| 中文摘要 | 第1-5页 |
| 英文摘要 | 第5-16页 |
| 第一部分:文献综述 | 第16-36页 |
| 第一章:牛病毒性腹泻病毒研究进展 | 第16-23页 |
| 1.BVD的临床表现和致病机理 | 第17-20页 |
| ·持续性感染与免疫耐受 | 第17页 |
| ·粘膜病与慢性型BVD | 第17-18页 |
| ·急性BVD | 第18-19页 |
| ·免疫抑制 | 第19页 |
| ·血小板减少症和出血综合征 | 第19-20页 |
| 2.流行病学 | 第20-21页 |
| 3.BVDV的免疫防制 | 第21-23页 |
| 第二章牛病毒性腹泻病毒检测与防制技术研究进展 | 第23-27页 |
| 1.牛病毒性腹泻病毒检测技术 | 第23-25页 |
| ·病毒的分离与鉴定 | 第23页 |
| ·血清学检测技术 | 第23页 |
| ·琼脂扩散试验 | 第23页 |
| ·血清中和试验(SNT) | 第23页 |
| ·免疫学检测技术 | 第23-25页 |
| ·免疫过氧化物酶(IP)技术 | 第24页 |
| ·酶联免疫吸附试验 | 第24-25页 |
| ·PCR检测方法 | 第25页 |
| ·核酸探针检测 | 第25页 |
| 2.BVDV防制 | 第25-27页 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒流行病学研究进展 | 第27-29页 |
| 第四章 牛病毒性腹泻病毒基因组结构与蛋白功能研究进展 | 第29-36页 |
| 1.BVDV基因组结构 | 第29页 |
| 2.BVDV的5′-UTR和3′-UTR | 第29-30页 |
| 3.BVDB的大开放阅读框架 | 第30-31页 |
| 4.BVDV的结构蛋白 | 第31-32页 |
| ·核心蛋白P14 | 第31页 |
| ·病毒囊膜结构蛋白 | 第31-32页 |
| ·囊膜蛋白gp48 | 第31-32页 |
| ·囊膜蛋白gp25 | 第32页 |
| ·囊膜蛋白gp53 | 第32页 |
| 5.BVDV非结构蛋白 | 第32-35页 |
| ·P20(N~(?)) | 第33页 |
| ·P7 | 第33页 |
| ·P125(NS2-3)、NS2和NS3 | 第33-34页 |
| ·P10(NS4A)和P30(NS4B) | 第34-35页 |
| ·P58(NS5A) | 第35页 |
| ·P75(NS5B) | 第35页 |
| 6.小结与展望 | 第35-36页 |
| 第二部分:实验研究 | 第36-101页 |
| 第五章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立 | 第36-42页 |
| 1.材料与方法 | 第36-39页 |
| ·病毒、细胞和酶标抗体 | 第36页 |
| ·实验动物 | 第36页 |
| ·BVDV抗原制备 | 第36-37页 |
| ·病毒的纯化-蔗糖密度梯度离心 | 第37页 |
| ·单克隆抗体的制备与纯化 | 第37页 |
| ·鸡抗BVDV IgY的制备 | 第37页 |
| ·待检样品的处理 | 第37-38页 |
| ·病毒细胞培养液的制备 | 第37-38页 |
| ·组织样品的制备 | 第38页 |
| ·粪样的制备 | 第38页 |
| ·AC-ELISA方法的建立 | 第38页 |
| ·AC-ELISA中单抗和多抗最佳工作浓度的筛选 | 第38页 |
| ·AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定 | 第38-39页 |
| ·AC-ELISA重复性试验 | 第39页 |
| ·AC-ELISA在实验感染和临床BVDV样品检验中的应用 | 第39页 |
| 2.结果 | 第39-40页 |
| ·单抗的制备与特性鉴定 | 第39页 |
| ·AC-ELISA中单抗和多抗最佳浓度的筛选 | 第39页 |
| ·AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定 | 第39-40页 |
| ·AC-ELISA方法重复性试验 | 第40页 |
| ·AC-ELISA在BVDV抗原检测中的临床应用 | 第40页 |
| 3.讨论 | 第40-42页 |
| 第六章 牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究 | 第42-56页 |
| 1.材料与方法 | 第42-46页 |
| ·主要试剂 | 第42-43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·样品 | 第43页 |
| ·引物设计及合成 | 第43页 |
| ·主要溶液配制 | 第43-44页 |
| ·质控血清的制备 | 第44页 |
| ·酶标板均一性检测 | 第44页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第44页 |
| ·抗原与单克隆抗体最佳结合浓度的确定 | 第44页 |
| ·抗原与抗体IgY与最佳结合浓度的选择 | 第44-45页 |
| ·封闭液及封闭时间的选择 | 第45页 |
| ·酶标抗体作用时间的选择 | 第45页 |
| ·底物显色时间的选择 | 第45页 |
| ·试剂盒的组装 | 第45页 |
| ·试剂盒敏感性检验及其对比试验 | 第45-46页 |
| ·试剂盒特异性检验 | 第46页 |
| ·阻断试验 | 第46页 |
| ·交叉试验 | 第46页 |
| ·试剂盒质量控制试验—Levey-Jennings质控图的绘制 | 第46页 |
| ·试剂盒的重复性和稳定性试验 | 第46页 |
| ·批内试验 | 第46页 |
| ·批间试验 | 第46页 |
| ·保存期试验 | 第46页 |
| 2.结果 | 第46-54页 |
| ·酶标板均一性检测 | 第46-47页 |
| ·酶标抗体工作浓度的确定 | 第47页 |
| ·抗原与单抗最佳结合浓度的确定 | 第47页 |
| ·抗BVDV IgY与抗原最佳结合浓度的确定 | 第47-48页 |
| ·封闭液及封闭时间的确定 | 第48-49页 |
| ·酶标抗体作用时间 | 第49页 |
| ·底物显色时间的选择 | 第49-50页 |
| ·试剂盒特异性检验 | 第50-51页 |
| ·阻断试验 | 第50页 |
| ·交叉试验 | 第50-51页 |
| ·试剂盒敏感性测定 | 第51页 |
| ·BVDV特异性引物RT-PCR扩增结果 | 第51页 |
| ·质控血清检测结果 | 第51-53页 |
| ·试剂盒稳定性检测 | 第53页 |
| ·试剂盒保存期试验结果 | 第53页 |
| ·试剂盒操作步骤 | 第53-54页 |
| 3.讨论 | 第54-56页 |
| 第七章 新疆北疆集约化奶牛场牛病毒性腹泻病毒病原学调查 | 第56-67页 |
| 1.材料与方法 | 第56-61页 |
| ·主要试剂 | 第56页 |
| ·主要仪器 | 第56-57页 |
| ·样品采集、处理 | 第57页 |
| ·引物设计合成 | 第57页 |
| ·主要溶液 | 第57-58页 |
| ·消化液(EDTA-胰酶) | 第57页 |
| ·细胞培养液(含20%胎牛血清替代剂的RPMI-1640) | 第57-58页 |
| ·维持液(含5%胎牛血清替代剂的RPMI-1640) | 第58页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒抗原检测 | 第58页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒阳性样品细胞培养 | 第58页 |
| ·MDBK细胞培养 | 第58页 |
| ·病毒接种细胞 | 第58页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定 | 第58-60页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第58页 |
| ·病毒型鉴定RT-PCR | 第58-60页 |
| ·不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析 | 第60-61页 |
| ·反转录体系 | 第60页 |
| ·PCR反应体系 | 第60页 |
| ·PCR产物的回收、连接、转化、克隆和测序 | 第60-61页 |
| ·序列分析比对 | 第61页 |
| 2.结果 | 第61-64页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒抗原检测 | 第61页 |
| ·牛病毒性腹泻病毒阳性样品基因型鉴定 | 第61-63页 |
| ·不同牛场牛病毒性腹泻病毒遗传进化分析 | 第63-64页 |
| 3.分析讨论 | 第64-67页 |
| ·结论 | 第64-65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| 第八章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆及序列分析 | 第67-78页 |
| 1.材料与方法 | 第67-72页 |
| ·材料 | 第67-69页 |
| ·毒株 | 第67页 |
| ·菌种和质粒 | 第67页 |
| ·主要试剂与工具酶 | 第67页 |
| ·引物设计与合成 | 第67-68页 |
| ·培养基与抗生素 | 第68页 |
| ·主要生化试剂与溶液的配制 | 第68-69页 |
| ·方法 | 第69-72页 |
| ·细胞毒BVDV总RNA的制备 | 第69页 |
| ·RT-PCR扩增目的基因 | 第69-70页 |
| ·RT-PCR产物的检测 | 第70页 |
| ·DNA目的片段的回收 | 第70页 |
| ·连接反应 | 第70页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第70-71页 |
| ·细菌的转化 | 第71页 |
| ·重组质粒的小量制备 | 第71页 |
| ·E2基因的鉴定及测序 | 第71-72页 |
| ·E2基因序列分析 | 第72页 |
| 2.结果 | 第72-76页 |
| ·RT-PCR的扩增结果 | 第72页 |
| ·目的基因的重组质粒鉴定结果 | 第72-73页 |
| ·E2基因序列测定及分析 | 第73页 |
| ·E2基因的同源性分析 | 第73-74页 |
| ·E2基因的进化分析 | 第74-76页 |
| 3.分析与讨论 | 第76-78页 |
| ·BVDV新疆分离株E2基因的克隆 | 第76页 |
| ·manasi、MNS分离株E2基因同CC-184株的进化关系 | 第76页 |
| ·新疆分离株E2基因的抗原表位分析 | 第76-77页 |
| ·新疆分离株E2基因的来源分析 | 第77-78页 |
| 第九章 BVDV新疆分离株E2基因的克隆表达 | 第78-96页 |
| 实验一 BVDV石河子株E2表达载体的构建及表达 | 第78-85页 |
| 1 材料与方法 | 第78-80页 |
| ·毒株质粒、菌株和细胞 | 第78页 |
| ·试剂 | 第78页 |
| ·引物的设计及合成 | 第78页 |
| ·RT-PCR | 第78-79页 |
| ·基因的克隆和鉴定 | 第79页 |
| ·基因序列分析及潜在抗原表位比较分析 | 第79页 |
| ·原核表达质粒的构建 | 第79页 |
| ·真核表达质粒的构建 | 第79-80页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第80页 |
| 2 结果 | 第80-83页 |
| ·E2基因的克隆 | 第80-81页 |
| ·E2基因核苷酸及氨基酸序列分析 | 第81页 |
| ·潜在抗原表位比较分析 | 第81页 |
| ·原核表达载体的构建与鉴定 | 第81-82页 |
| ·真核表达载体的构建与鉴定 | 第82-83页 |
| ·E2基因的表达及检测 | 第83页 |
| ·E2蛋白在原核系统中的表达及检测 | 第83页 |
| ·E2蛋白在真核系统中的表达及检测 | 第83页 |
| 3 讨论 | 第83-85页 |
| 实验二 BVDV玛纳斯株E2基因主要抗原表位区域的分段表达 | 第85-96页 |
| 1 材料与方法 | 第85-88页 |
| ·毒株与BVDV阳性和阴性血清 | 第85-86页 |
| ·试剂 | 第86页 |
| ·引物的设计及合成 | 第86页 |
| ·RT-PCR及基因的克隆和鉴定 | 第86页 |
| ·序列分析及二级结构预测 | 第86-87页 |
| ·分段表达质粒的构建 | 第87页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第87页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳 | 第87-88页 |
| ·重组蛋白的Western blot检测 | 第88页 |
| 2 结果 | 第88-94页 |
| ·RT-PCR的扩增结果与鉴定 | 第88-89页 |
| ·序列分析 | 第89页 |
| ·二级结构及抗原表位预测 | 第89-90页 |
| ·表达重组载体的构建与鉴定 | 第90-92页 |
| ·诱导表达SDS-PAGE电泳结果 | 第92-93页 |
| ·Western blotting分析 | 第93-94页 |
| 3 讨论与结论 | 第94-96页 |
| 第十章:BVDV -E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立 | 第96-101页 |
| 1.材料与方法 | 第96-97页 |
| ·质粒 | 第96页 |
| ·试剂 | 第96页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第96页 |
| ·重组蛋白的特异性检测 | 第96页 |
| ·重组蛋白的纯化及纯化蛋白活性检 | 第96-97页 |
| ·重组蛋白质的包被及定量 | 第97页 |
| ·间接ELISA检测方法的建立 | 第97页 |
| 2.结果 | 第97-99页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第97页 |
| ·重组蛋白的特异性检测 | 第97-98页 |
| ·纯化后重组蛋白的SDS-PAGE及Western-blot检测 | 第98页 |
| ·方阵滴定试验 | 第98-99页 |
| ·样品检测结果 | 第99页 |
| 3.分析讨论 | 第99-101页 |
| 第三部分 结论 | 第101-103页 |
| 第四部分 参考文献 | 第103-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 攻读博士期间发表的论文、获奖情况 | 第118-119页 |
| 论文 | 第118页 |
| 获奖 | 第118-119页 |
| 资助项目 | 第119页 |
