| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-14页 |
| 目录 | 第14-18页 |
| 图表目录 | 第18-21页 |
| 前言 | 第21-24页 |
| 第一章 十字花科植物硫代葡萄营及其降解产物 | 第24-38页 |
| 1. 硫代葡萄糖苷 | 第24-28页 |
| ·硫代葡萄糖甘的化学结构和性质 | 第24-25页 |
| ·植物中硫代葡萄糖苷的分布 | 第25-26页 |
| ·硫代葡萄糖苷的分离与检测 | 第26-28页 |
| 2. 异硫氰酸酯及其生物学活性 | 第28-36页 |
| ·硫苷降解产物 | 第29-30页 |
| ·异硫氰酸酯的化学结构和性质 | 第30页 |
| ·异硫代氰酸酯的生物学活性 | 第30-36页 |
| 3. 硫代葡萄糖苷及其降解产物的安全性 | 第36-37页 |
| 4. 硫代葡萄糖苷酯及其降解物的开发及应用前景 | 第37-38页 |
| 第二章 硫代葡萄糖苷的代谢和转运研究进展 | 第38-47页 |
| 1. 硫苷的生物合成 | 第38-41页 |
| ·醛肟形成相关酶 | 第38-39页 |
| ·硫苷生物合成的进化 | 第39-40页 |
| ·参与硫苷生物合成的细胞色素P450的基因 | 第40页 |
| ·硫化肟、脱硫硫苷和硫苷的形成 | 第40-41页 |
| ·侧链延伸与修饰最新进展 | 第41页 |
| 2. 硫苷的降解 | 第41-43页 |
| ·硫苷和硫苷酶的区室化 | 第41-42页 |
| ·硫甘酶的同工酶和蛋白复合物 | 第42页 |
| ·硫苷的转运 | 第42-43页 |
| 3. 硫苷代谢的调节 | 第43-45页 |
| ·合成调节 | 第44页 |
| ·降解的调节 | 第44-45页 |
| 4. 硫苷代谢与生长调节和防御 | 第45-46页 |
| 5. 硫苷-硫苷酶的基因工程 | 第46-47页 |
| 第三章 硫代葡萄糖苷酶研究进展 | 第47-67页 |
| 1. 硫苷酶的生物体内分布和细胞内定位 | 第47-50页 |
| ·植物器官和组织分布 | 第47-48页 |
| ·细胞内定位 | 第48-49页 |
| ·其它生物体的硫苷酶 | 第49-50页 |
| 2. 植物组织中硫代葡萄糖苷酶的定位方法 | 第50-51页 |
| 3. 硫代葡萄糖苷酶的分离纯化和鉴定技术 | 第51-55页 |
| ·分离纯化技术 | 第51-52页 |
| ·硫苷酶活性测定方法 | 第52-55页 |
| 4. 硫苷酶酶活的影响因素 | 第55-58页 |
| ·pH对硫苷酶酶活影响 | 第55-56页 |
| ·温度对硫营酶酶活影响 | 第56-57页 |
| ·金属离子的影响 | 第57页 |
| ·V_C对硫苷酶酶活的影响 | 第57-58页 |
| 5. 硫苷酶的空间结构和催化机理 | 第58-61页 |
| ·酶的立体结构 | 第58-59页 |
| ·酶催化的可能机理 | 第59-61页 |
| 6. 硫代葡萄糖苷酶基因的克隆和表达 | 第61-63页 |
| ·基因家族和基本结构 | 第61-62页 |
| ·克隆和表达 | 第62-63页 |
| 7. 硫代葡萄糖苷酶结合蛋白和相关蛋白 | 第63-66页 |
| ·分类 | 第63-64页 |
| ·MBP、MyAP表达和分布 | 第64-65页 |
| ·作用和功能 | 第65-66页 |
| 8. 硫苷酶及硫苷-硫苷酶体系的功能 | 第66-67页 |
| 第四章 萝卜硫素体外抗肿瘤活性测定及其机理初步研究 | 第67-84页 |
| 1. 材料与方法 | 第68-72页 |
| ·实验材料 | 第68页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第68页 |
| ·实验方法 | 第68-72页 |
| ·瘤细胞株的复苏、培养和冻存 | 第69页 |
| ·MTT法检测萝卜硫素对细胞增殖的影响 | 第69-70页 |
| ·MTT检测萝卜硫素不同作用时间对A172细胞增殖的影响 | 第70页 |
| ·Hoechst检测凋亡细胞核形态 | 第70页 |
| ·Annexin V/P1双染法检测细胞凋亡 | 第70-71页 |
| ·流式细胞术检测细胞周期 | 第71页 |
| ·DNA提取与电泳分析 | 第71页 |
| ·核酸的琼脂糖凝胶电泳 | 第71-72页 |
| 2. 结果 | 第72-82页 |
| ·MTT法检测萝卜硫素对细胞增殖的影响 | 第72-74页 |
| ·MTT检测萝卜硫素对A172细胞增殖的影响 | 第74-75页 |
| ·Hoechst检测凋亡细胞核形态 | 第75-77页 |
| ·Annexin V/P1双染法检测细胞凋亡 | 第77-79页 |
| ·流式细胞术检测细胞周期 | 第79-80页 |
| ·DNA发生特异降解而形成梯状电泳(DNA ladder) | 第80-82页 |
| 3. 讨论 | 第82-84页 |
| 第五章 西兰花(BRASSICA OLERACEA VAR.ITALICA)硫代葡萄糖苷酶基因cDNA克隆及其特征分析 | 第84-107页 |
| 1. 材料与方法 | 第84-93页 |
| ·植物材料和菌株、质粒 | 第84-85页 |
| ·酶和主要试剂 | 第85页 |
| ·培养基 | 第85页 |
| ·RNA的提取 | 第85-86页 |
| ·引物设计 | 第86-87页 |
| ·PCR扩增特异的cDNA片段 | 第87页 |
| ·3’RACE | 第87页 |
| ·5’RACE | 第87-91页 |
| ·DNA片段的回收、克隆和序列测定 | 第91-92页 |
| ·核甘酸序列分析、同源比对和系统树构建 | 第92-93页 |
| ·蛋白三维空间结构建模、分子模型的显示、计算和结构对比 | 第93页 |
| 2. 结果分析 | 第93-102页 |
| ·西兰花硫代葡萄糖苷酶基因cDNA全长的克隆 | 第93-94页 |
| ·西兰花硫代葡萄糖苷酶基因的序列分析 | 第94-96页 |
| ·西兰花硫代葡萄糖甘酶基因的蛋白结构特征分析 | 第96-98页 |
| ·蛋白结构模拟与比较分析 | 第98-100页 |
| ·硫甘酶的进化分析 | 第100-102页 |
| 3. 讨论 | 第102-107页 |
| 第六章 硫代葡萄糖苷酶原核表达载体的构建及其表达研究 | 第107-118页 |
| 1. 材料与方法 | 第107-111页 |
| ·植物材料和菌株、质粒 | 第107-108页 |
| ·酶和主要试剂 | 第108页 |
| ·西兰花RNA的提取 | 第108页 |
| ·BoMyr2基因的克隆 | 第108-109页 |
| ·融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-BoMyr2的构建 | 第109页 |
| ·基因的诱导发达 | 第109-110页 |
| ·融合蛋白活性的测定 | 第110-111页 |
| 2. 结果 | 第111-115页 |
| ·西兰花幼苗的培育 | 第111-112页 |
| ·BoMyr2基因成熟肽链编码区的克隆及酶切鉴定 | 第112页 |
| ·pMD18-T-BoMyr2克隆的构建和鉴定 | 第112-113页 |
| ·表达载体pGEX-4T-1-BoMyr2的构建与鉴定 | 第113-114页 |
| ·基因的诱导表达 | 第114页 |
| ·融合蛋白的活性测定 | 第114-115页 |
| 3. 讨论 | 第115-118页 |
| 第七章 西兰花硫代葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母KM71中的表达 | 第118-139页 |
| 1. 材料与方法 | 第119-125页 |
| ·植物材料和菌株、质粒 | 第119页 |
| ·酶和主要试剂 | 第119页 |
| ·培养基 | 第119-120页 |
| ·BoMyr2基因成熟肽编码区的克隆 | 第120页 |
| ·PMD18-T-BoMyr2和pPIC9K的双酶切 | 第120-121页 |
| ·蛋白表达载体pPIC9K-BoMyr2的构建 | 第121-123页 |
| ·蛋白表达载体pPIC9K-BoMyr2的线性化和电转酵母 | 第123页 |
| ·分泌型蛋白的诱导表达 | 第123-124页 |
| ·重组酵母全细胞蛋白电泳 | 第124页 |
| ·重组酵母培养物上清的浓缩与活性测定 | 第124页 |
| ·重组酵母培养物上清的酶活测定 | 第124-125页 |
| ·Bradford法测定酵母培养物上清蛋白含量 | 第125页 |
| ·重组酵母培养物上清酶解Glucoraphanin的活性 | 第125页 |
| 2. 结果 | 第125-136页 |
| ·BoMyr2基因成熟肽链编码区的克隆、PMD-18-T-BoMyr2的构建与鉴定 | 第125-126页 |
| ·蛋白表达载体pPIC9K-BoMyr2的构建 | 第126-128页 |
| ·蛋白表达载体pPIC9K-BoMyr2的线性化和酵母阳性菌落的筛选 | 第128-129页 |
| ·硫苷酶的小量表达 | 第129-131页 |
| ·酵母发酵液上清硫苷酶活性测定 | 第131-134页 |
| ·重组酵母培养物上清的浓缩与活性测定 | 第134-135页 |
| ·重组酵母培养物上清催化Glucoraphanin活性 | 第135-136页 |
| 3. 讨论 | 第136-139页 |
| 第八章 重组毕赤酵母发酵生产硫苷酶的条件优化初探 | 第139-149页 |
| 1. 材料与方法 | 第139-142页 |
| ·菌种 | 第139页 |
| ·培养基和培养方法 | 第139-140页 |
| ·外源蛋白表达条件试验 | 第140-141页 |
| ·粗酶液制备 | 第141页 |
| ·蛋白检测方法 | 第141页 |
| ·硫苷酶酶活测定 | 第141页 |
| ·Vc对硫甘酶酶活的影响 | 第141-142页 |
| ·数据处理 | 第142页 |
| 2. 结果与分析 | 第142-147页 |
| ·发酵时间的影响 | 第142页 |
| ·不同pH对表达外源蛋白的影响 | 第142-143页 |
| ·甲醇浓度对酵母蛋白表达的影响 | 第143-144页 |
| ·油酸对蛋白表达的影响 | 第144-145页 |
| ·表面活性剂Tween的影响 | 第145-146页 |
| ·Vc对酶活的影响测定 | 第146-147页 |
| 3. 讨论 | 第147-149页 |
| 主要结论与工作设想 | 第149-151页 |
| 1. 主要研究结论 | 第149-150页 |
| 2. 下一步的工作设想 | 第150-151页 |
| 主要创新点 | 第151-153页 |
| 参考文献 | 第153-164页 |
| 附录A:本文所用载体图谱 | 第164-166页 |
| 附录B:GENBANK收录的硫代葡萄糖苷酶基因、蛋白序列 | 第166-169页 |
| 附录C:英文缩略语 | 第169-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
