| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第1章 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 淀粉与淀粉酶 | 第13页 |
| 1.2 淀粉酶的分类 | 第13-14页 |
| 1.2.1 α-淀粉酶 | 第13-14页 |
| 1.2.2 β-淀粉酶 | 第14页 |
| 1.2.3 葡糖淀粉酶 | 第14页 |
| 1.3 α-淀粉酶的特性 | 第14-17页 |
| 1.3.1 α-淀粉酶的理化性质 | 第14-15页 |
| 1.3.2 α-淀粉酶的一级结构特征 | 第15-16页 |
| 1.3.3 α-淀粉酶的三级结构特征 | 第16页 |
| 1.3.4 α-淀粉酶的催化机制 | 第16-17页 |
| 1.4 碱性α-淀粉酶 | 第17-19页 |
| 1.4.1 碱性α-淀粉酶的研究概述 | 第17-18页 |
| 1.4.2 碱性α-淀粉酶的工业应用 | 第18-19页 |
| 1.4.2.1 碱性α-淀粉酶在纺织工业中的应用 | 第18页 |
| 1.4.2.2 碱性α-淀粉酶在洗涤添加剂中的应用 | 第18页 |
| 1.4.2.3 碱性α-淀粉酶在其他工业领域中的应用 | 第18-19页 |
| 1.5 碱性α-淀粉酶的分子改造策略 | 第19-20页 |
| 1.5.1 定向进化 | 第19页 |
| 1.5.2 理性设计 | 第19-20页 |
| 1.5.3 计算机辅助设计 | 第20页 |
| 1.6 立题依据及研究意义 | 第20-21页 |
| 1.7 本论文的主要研究内容 | 第21-23页 |
| 第二章 碱性淀粉酶的克隆及酶学性质分析 | 第23-42页 |
| 2.1 材料与方法 | 第23-30页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1.1 质粒与菌株 | 第23页 |
| 2.1.1.2 培养基、培养方法和抗生素使用浓度 | 第23页 |
| 2.1.1.3 PCR引物 | 第23-24页 |
| 2.1.1.4 酶和试剂 | 第24页 |
| 2.1.1.5 主要仪器 | 第24页 |
| 2.1.1.6 主要缓冲液 | 第24-25页 |
| 2.1.2 分子生物学操作 | 第25-27页 |
| 2.1.2.1 碱性淀粉酶产生菌株的筛选 | 第25页 |
| 2.1.2.2 细菌总DNA的提取 | 第25页 |
| 2.1.2.3 菌株鉴定和目的基因的获取 | 第25-26页 |
| 2.1.2.4 重组表达载体的构建 | 第26页 |
| 2.1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第26-27页 |
| 2.1.2.6 重组克隆的验证 | 第27页 |
| 2.1.2.7 定点突变 | 第27页 |
| 2.1.3 蛋白质分析方法 | 第27-30页 |
| 2.1.3.1 Amy703的氨基酸序列比对与二级结构分析 | 第27页 |
| 2.1.3.2 Amy703的聚类分析 | 第27-28页 |
| 2.1.3.3 碱性α-淀粉酶酶活测定方法 | 第28页 |
| 2.1.3.4 碱性淀粉酶纯化条件与方法 | 第28-29页 |
| 2.1.3.5 蛋白浓度测定方法 | 第29页 |
| 2.1.3.6 SDS-PAGE检测 | 第29页 |
| 2.1.3.7 温度对酶活性及稳定性的影响 | 第29页 |
| 2.1.3.8 pH对酶活性及稳定性的影响 | 第29页 |
| 2.1.3.9 盐离子对酶活性的影响 | 第29页 |
| 2.1.3.10 底物特异性分析 | 第29-30页 |
| 2.1.3.11 动力学参数测定 | 第30页 |
| 2.1.3.12 圆二色谱分析 | 第30页 |
| 2.2 结果与分析 | 第30-39页 |
| 2.2.1 碱性淀粉酶产生菌的分离及鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.2 淀粉酶Amy703基因的获得与分析 | 第31-32页 |
| 2.2.3 Amy703的氨基酸序列分析 | 第32-34页 |
| 2.2.3.1 氨基酸序列分析 | 第32页 |
| 2.2.3.2 α-淀粉酶保守序列区域分析 | 第32-34页 |
| 2.2.3.3 Amy703的聚类分析 | 第34页 |
| 2.2.4 重组表达载体的构建 | 第34-36页 |
| 2.2.5 Amy703的异源表达及纯化 | 第36页 |
| 2.2.6 Amy703的酶学性质分析 | 第36-39页 |
| 2.2.6.1 温度对Amy703活性及稳定性的影响 | 第36-37页 |
| 2.2.6.2 pH对Amy703活性及稳定性的影响 | 第37页 |
| 2.2.6.3 金属离子对Amy70活性的影响 | 第37-38页 |
| 2.2.6.4 Amy703的底物特异性 | 第38-39页 |
| 2.2.6.5 Amy703的动力学参数 | 第39页 |
| 2.2.7 定点突变和圆二色谱仪分析验证催化三联体 | 第39页 |
| 2.3 讨论 | 第39-42页 |
| 第三章: 基于同源结构模拟的Amy703结构域改造 | 第42-57页 |
| 3.1 材料与方法 | 第42-44页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第42页 |
| 3.1.1.1 菌株与质粒 | 第42页 |
| 3.1.1.2 培养基、培养方法和抗生素使用浓度 | 第42页 |
| 3.1.1.3 PCR引物 | 第42页 |
| 3.1.1.4 酶和试剂 | 第42页 |
| 3.1.1.5 主要仪器 | 第42页 |
| 3.1.1.6 主要缓冲液 | 第42页 |
| 3.1.2 分子生物学操作 | 第42-43页 |
| 3.1.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第42页 |
| 3.1.2.2 突变体的构建 | 第42页 |
| 3.1.2.3 重组克隆的验证 | 第42-43页 |
| 3.1.3 蛋白质分析 | 第43-44页 |
| 3.1.3.1 Amy703及其突变体的结构模拟与分析 | 第43页 |
| 3.1.3.2 碱性α-淀粉酶酶活测定方法 | 第43页 |
| 3.1.3.3 碱性淀粉酶纯化条件与方法 | 第43页 |
| 3.1.3.4 SDS-PAGE检测 | 第43页 |
| 3.1.3.5 温度对酶活性及稳定性的影响 | 第43页 |
| 3.1.3.6 pH对酶活性及稳定性的影响 | 第43页 |
| 3.1.3.7 金属离子对酶活性的影响 | 第43页 |
| 3.1.3.8 底物特异性分析 | 第43页 |
| 3.1.3.9 动力学参数测定 | 第43-44页 |
| 3.2 结果与分析 | 第44-53页 |
| 3.2.1 Amy703的同源结构模拟 | 第44页 |
| 3.2.2 Amy703的结构域改造 | 第44-45页 |
| 3.2.3 突变体的表达和纯化 | 第45-46页 |
| 3.2.4 突变体的比酶活分析 | 第46页 |
| 3.2.5 温度对N-Amy703活性及稳定性的影响 | 第46-47页 |
| 3.2.6 pH对Amy703活性及稳定性的影响 | 第47-48页 |
| 3.2.7 金属离子对N-Amy703活性的影响 | 第48-49页 |
| 3.2.8 N-Amy703的底物特异性 | 第49页 |
| 3.2.9 N-Amy703的动力学参数 | 第49页 |
| 3.2.10 N端结构域序列分析 | 第49-50页 |
| 3.2.11 Amy703与N-Amy703的底物结合实验 | 第50页 |
| 3.2.12 N-Amy703的同源结构模拟与分析 | 第50-53页 |
| 3.2.12.1 N-Amy703的同源结构模拟 | 第50-51页 |
| 3.2.12.2 蛋白质结构分析 | 第51-53页 |
| 3.3 讨论 | 第53-57页 |
| 结论 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-65页 |
| 附录: 作者在攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第65-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
