| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第10-20页 |
| 1.1 蛋白酶概述 | 第10页 |
| 1.2 碱性蛋白酶定义 | 第10页 |
| 1.3 碱性蛋白酶应用 | 第10-11页 |
| 1.3.1 碱性蛋白酶在洗涤剂工业中的应用 | 第10-11页 |
| 1.3.2 碱性蛋白酶在医药工业中的应用 | 第11页 |
| 1.3.3 碱性蛋白酶在食品加工行业中的应用 | 第11页 |
| 1.3.4 碱性蛋白酶在皮革加工行业中的应用 | 第11页 |
| 1.4 碱性蛋白酶研究进展 | 第11-13页 |
| 1.4.1 碱性蛋白酶的主要生产菌 | 第11-12页 |
| 1.4.2 碱性蛋白酶国内外研究进展 | 第12-13页 |
| 1.5 地衣芽胞杆菌表达系统 | 第13页 |
| 1.6 乳蛋白源的生物活性肽 | 第13-14页 |
| 1.7 酪蛋白磷酸肽 | 第14-18页 |
| 1.7.1 酪蛋白磷酸肽定义 | 第14页 |
| 1.7.2 酪蛋白磷酸肽的结构 | 第14页 |
| 1.7.3 酪蛋白磷酸肽理化特性 | 第14-15页 |
| 1.7.4 酪蛋白磷酸肽生理毒性研究 | 第15页 |
| 1.7.5 酪蛋白磷酸肽的功能 | 第15-16页 |
| 1.7.6 酪蛋白磷酸肽的制备方法 | 第16-17页 |
| 1.7.7 酪蛋白磷酸肽的分离 | 第17-18页 |
| 1.7.8 酪蛋白磷酸肽质量评价方法 | 第18页 |
| 1.8 本论文的研究意义及内容 | 第18-20页 |
| 1.8.1 研究意义 | 第18-19页 |
| 1.8.2 研究内容 | 第19-20页 |
| 2 材料和方法 | 第20-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-23页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 实验试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.3 仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.1.4 培养基 | 第22-23页 |
| 2.2 实验溶液 | 第23-26页 |
| 2.2.1 核酸电泳溶液 | 第23-24页 |
| 2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液 | 第24页 |
| 2.2.3 酶活力测定溶液 | 第24-25页 |
| 2.2.4 酶学性质测定溶液 | 第25页 |
| 2.2.5 总磷含量测定溶液 | 第25-26页 |
| 2.2.6 其他溶液 | 第26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-41页 |
| 2.3.1 嗜碱芽胞杆菌染色体DNA提取 | 第26-27页 |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 | 第27-31页 |
| 2.3.4 枯草芽胞杆菌感受态制备与转化 | 第31页 |
| 2.3.5 重组菌WB600/pHY-WZX-apr的筛选与验证 | 第31-32页 |
| 2.3.6 重组质粒pHY-WZX-apr的提取 | 第32页 |
| 2.3.7 地衣芽胞杆菌H115感受态制备与电击转化 | 第32-33页 |
| 2.3.8 重组菌H115/pHY-WZX-apr的筛选与验证 | 第33页 |
| 2.3.9 SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况 | 第33-34页 |
| 2.3.10 重组质粒在地衣芽胞杆菌中的稳定性检测 | 第34页 |
| 2.3.11 蛋白酶活测定 | 第34-35页 |
| 2.3.12 酶的分离纯化 | 第35-36页 |
| 2.3.13 重组碱性蛋白酶与两种市售蛋白酶酶学性质的比较 | 第36-37页 |
| 2.3.14 产酶培养基和产酶条件的优化 | 第37页 |
| 2.3.15 重组碱性蛋白酶与两种市售蛋白酶水解度的比较 | 第37-39页 |
| 2.3.16 重组碱性蛋白酶水解条件的优化 | 第39页 |
| 2.3.17 重组碱性蛋白酶制备酪蛋白磷酸肽 | 第39页 |
| 2.3.18 酪蛋白磷酸肽纯度检测 | 第39-41页 |
| 3 结果与讨论 | 第41-66页 |
| 3.1 出发菌株的菌体形态和产酶稳定性 | 第41-42页 |
| 3.1.1 出发菌株菌体形态 | 第41页 |
| 3.1.2 出发菌株产酶稳定性 | 第41-42页 |
| 3.2 重组菌B.licheniformis H115/pHY-WZX-apr的构建 | 第42-44页 |
| 3.2.1 嗜碱芽胞杆菌染色体DNA的提取 | 第42页 |
| 3.2.2 碱性蛋白酶基因apr的克隆和扩增 | 第42页 |
| 3.2.3 质粒pHY-WZX的提取 | 第42-43页 |
| 3.2.4 重组载体的酶切验证 | 第43-44页 |
| 3.2.5 目的基因序列分析 | 第44页 |
| 3.3 重组菌Blicheniformis H115/pHY-WZX-apr的表达 | 第44-46页 |
| 3.3.1 平板初筛 | 第44-45页 |
| 3.3.2 SDS-PAGE电泳分析 | 第45页 |
| 3.3.3 酶活力测定 | 第45-46页 |
| 3.4 重组质粒pHY-WZX-apr在地衣芽胞杆菌中的稳定性 | 第46页 |
| 3.5 碱性蛋白酶的分离纯化 | 第46-48页 |
| 3.5.1 盐析 | 第46-47页 |
| 3.5.2 超滤浓缩除盐 | 第47页 |
| 3.5.3 重组碱性蛋白酶的纯度鉴定及分子量测定 | 第47-48页 |
| 3.6 重组碱性蛋白酶与市售蛋白酶酶学性质比较 | 第48-52页 |
| 3.6.1 三种蛋白酶最适反应温度的比较 | 第48页 |
| 3.6.2 三种蛋白酶的热稳定性的比较 | 第48-50页 |
| 3.6.3 三种蛋白酶最适反应pH的比较 | 第50-51页 |
| 3.6.4 三种蛋白酶pH稳定性的比较 | 第51页 |
| 3.6.5 金属离子对三种蛋白酶活力影响的比较 | 第51-52页 |
| 3.7 产酶培养基的优化 | 第52-58页 |
| 3.7.1 不同碳源对产酶的影响 | 第52-53页 |
| 3.7.2 乳糖浓度对产酶的影响 | 第53-54页 |
| 3.7.3 有机氮源种类对产酶的影响 | 第54页 |
| 3.7.4 豆饼粉浓度对产酶的影响 | 第54-55页 |
| 3.7.5 无机氮源种类对产酶的影响 | 第55-56页 |
| 3.7.6 氯化铵浓度对产酶的影响 | 第56页 |
| 3.7.7 磷酸盐浓度对产酶的影响 | 第56-57页 |
| 3.7.8 发酵优化的正交实验 | 第57-58页 |
| 3.8 摇瓶产酶工艺参数的优化 | 第58-61页 |
| 3.8.1 重组菌生长曲线的测定 | 第58-59页 |
| 3.8.2 种龄对产酶的影响 | 第59-60页 |
| 3.8.3 接种量对产酶的影响 | 第60页 |
| 3.8.4 培养温度对产酶的影响 | 第60-61页 |
| 3.9 重组碱性蛋白酶与市售蛋白酶水解度比较 | 第61-62页 |
| 3.10 重组碱性蛋白酶水解条件的优化 | 第62-64页 |
| 3.10.1 温度对水解度的影响 | 第62页 |
| 3.10.2 pH值对水解度的影响 | 第62-63页 |
| 3.10.3 酶添加量对水解度的影响 | 第63-64页 |
| 3.10.4 正交实验确定最优水解条件 | 第64页 |
| 3.11 重组碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽 | 第64-66页 |
| 3.11.1 酪蛋白磷酸肽得率 | 第64-65页 |
| 3.11.2 酪蛋白磷酸肽纯度 | 第65-66页 |
| 4 结论 | 第66-67页 |
| 5 展望 | 第67-68页 |
| 6 参考文献 | 第68-74页 |
| 7 论文发表情况 | 第74-75页 |
| 8 致谢 | 第75页 |
