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嗜碱芽胞杆菌碱性蛋白酶的高效表达及应用

摘要第4-5页
ABSTRACT第5页
1 前言第10-20页
    1.1 蛋白酶概述第10页
    1.2 碱性蛋白酶定义第10页
    1.3 碱性蛋白酶应用第10-11页
        1.3.1 碱性蛋白酶在洗涤剂工业中的应用第10-11页
        1.3.2 碱性蛋白酶在医药工业中的应用第11页
        1.3.3 碱性蛋白酶在食品加工行业中的应用第11页
        1.3.4 碱性蛋白酶在皮革加工行业中的应用第11页
    1.4 碱性蛋白酶研究进展第11-13页
        1.4.1 碱性蛋白酶的主要生产菌第11-12页
        1.4.2 碱性蛋白酶国内外研究进展第12-13页
    1.5 地衣芽胞杆菌表达系统第13页
    1.6 乳蛋白源的生物活性肽第13-14页
    1.7 酪蛋白磷酸肽第14-18页
        1.7.1 酪蛋白磷酸肽定义第14页
        1.7.2 酪蛋白磷酸肽的结构第14页
        1.7.3 酪蛋白磷酸肽理化特性第14-15页
        1.7.4 酪蛋白磷酸肽生理毒性研究第15页
        1.7.5 酪蛋白磷酸肽的功能第15-16页
        1.7.6 酪蛋白磷酸肽的制备方法第16-17页
        1.7.7 酪蛋白磷酸肽的分离第17-18页
        1.7.8 酪蛋白磷酸肽质量评价方法第18页
    1.8 本论文的研究意义及内容第18-20页
        1.8.1 研究意义第18-19页
        1.8.2 研究内容第19-20页
2 材料和方法第20-41页
    2.1 实验材料第20-23页
        2.1.1 菌种与质粒第20页
        2.1.2 实验试剂第20-21页
        2.1.3 仪器设备第21-22页
        2.1.4 培养基第22-23页
    2.2 实验溶液第23-26页
        2.2.1 核酸电泳溶液第23-24页
        2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液第24页
        2.2.3 酶活力测定溶液第24-25页
        2.2.4 酶学性质测定溶液第25页
        2.2.5 总磷含量测定溶液第25-26页
        2.2.6 其他溶液第26页
    2.3 实验方法第26-41页
        2.3.1 嗜碱芽胞杆菌染色体DNA提取第26-27页
        2.3.2 琼脂糖凝胶电泳第27页
        2.3.3 重组质粒的构建第27-31页
        2.3.4 枯草芽胞杆菌感受态制备与转化第31页
        2.3.5 重组菌WB600/pHY-WZX-apr的筛选与验证第31-32页
        2.3.6 重组质粒pHY-WZX-apr的提取第32页
        2.3.7 地衣芽胞杆菌H115感受态制备与电击转化第32-33页
        2.3.8 重组菌H115/pHY-WZX-apr的筛选与验证第33页
        2.3.9 SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况第33-34页
        2.3.10 重组质粒在地衣芽胞杆菌中的稳定性检测第34页
        2.3.11 蛋白酶活测定第34-35页
        2.3.12 酶的分离纯化第35-36页
        2.3.13 重组碱性蛋白酶与两种市售蛋白酶酶学性质的比较第36-37页
        2.3.14 产酶培养基和产酶条件的优化第37页
        2.3.15 重组碱性蛋白酶与两种市售蛋白酶水解度的比较第37-39页
        2.3.16 重组碱性蛋白酶水解条件的优化第39页
        2.3.17 重组碱性蛋白酶制备酪蛋白磷酸肽第39页
        2.3.18 酪蛋白磷酸肽纯度检测第39-41页
3 结果与讨论第41-66页
    3.1 出发菌株的菌体形态和产酶稳定性第41-42页
        3.1.1 出发菌株菌体形态第41页
        3.1.2 出发菌株产酶稳定性第41-42页
    3.2 重组菌B.licheniformis H115/pHY-WZX-apr的构建第42-44页
        3.2.1 嗜碱芽胞杆菌染色体DNA的提取第42页
        3.2.2 碱性蛋白酶基因apr的克隆和扩增第42页
        3.2.3 质粒pHY-WZX的提取第42-43页
        3.2.4 重组载体的酶切验证第43-44页
        3.2.5 目的基因序列分析第44页
    3.3 重组菌Blicheniformis H115/pHY-WZX-apr的表达第44-46页
        3.3.1 平板初筛第44-45页
        3.3.2 SDS-PAGE电泳分析第45页
        3.3.3 酶活力测定第45-46页
    3.4 重组质粒pHY-WZX-apr在地衣芽胞杆菌中的稳定性第46页
    3.5 碱性蛋白酶的分离纯化第46-48页
        3.5.1 盐析第46-47页
        3.5.2 超滤浓缩除盐第47页
        3.5.3 重组碱性蛋白酶的纯度鉴定及分子量测定第47-48页
    3.6 重组碱性蛋白酶与市售蛋白酶酶学性质比较第48-52页
        3.6.1 三种蛋白酶最适反应温度的比较第48页
        3.6.2 三种蛋白酶的热稳定性的比较第48-50页
        3.6.3 三种蛋白酶最适反应pH的比较第50-51页
        3.6.4 三种蛋白酶pH稳定性的比较第51页
        3.6.5 金属离子对三种蛋白酶活力影响的比较第51-52页
    3.7 产酶培养基的优化第52-58页
        3.7.1 不同碳源对产酶的影响第52-53页
        3.7.2 乳糖浓度对产酶的影响第53-54页
        3.7.3 有机氮源种类对产酶的影响第54页
        3.7.4 豆饼粉浓度对产酶的影响第54-55页
        3.7.5 无机氮源种类对产酶的影响第55-56页
        3.7.6 氯化铵浓度对产酶的影响第56页
        3.7.7 磷酸盐浓度对产酶的影响第56-57页
        3.7.8 发酵优化的正交实验第57-58页
    3.8 摇瓶产酶工艺参数的优化第58-61页
        3.8.1 重组菌生长曲线的测定第58-59页
        3.8.2 种龄对产酶的影响第59-60页
        3.8.3 接种量对产酶的影响第60页
        3.8.4 培养温度对产酶的影响第60-61页
    3.9 重组碱性蛋白酶与市售蛋白酶水解度比较第61-62页
    3.10 重组碱性蛋白酶水解条件的优化第62-64页
        3.10.1 温度对水解度的影响第62页
        3.10.2 pH值对水解度的影响第62-63页
        3.10.3 酶添加量对水解度的影响第63-64页
        3.10.4 正交实验确定最优水解条件第64页
    3.11 重组碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽第64-66页
        3.11.1 酪蛋白磷酸肽得率第64-65页
        3.11.2 酪蛋白磷酸肽纯度第65-66页
4 结论第66-67页
5 展望第67-68页
6 参考文献第68-74页
7 论文发表情况第74-75页
8 致谢第75页

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