| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 N-乙酰氨基葡萄糖概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 N-乙酰氨基葡萄糖的性质 | 第10页 |
| 1.1.2 GlcNAc的功能和应用 | 第10-11页 |
| 1.1.3 GlcNAc的生产 | 第11-12页 |
| 1.2 枯草芽孢杆菌概述 | 第12-13页 |
| 1.2.1 B.subtilis的特性及应用 | 第12页 |
| 1.2.2 B.subtilis的基因表达调控 | 第12-13页 |
| 1.3 中心代谢概述 | 第13-17页 |
| 1.3.1 中心碳代谢 | 第13-15页 |
| 1.3.2 中心氮代谢 | 第15-17页 |
| 1.4 本论文主要研究内容 | 第17-20页 |
| 1.4.1 立题依据和研究意义 | 第17-18页 |
| 1.4.2 本论文主要研究内容 | 第18-20页 |
| 第二章 阻断中心碳代谢溢流促进GlcNAc积累 | 第20-34页 |
| 2.1 前言 | 第20-21页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第21-24页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和培养条件 | 第21页 |
| 2.2.2 阻断乙偶姻合成 | 第21-22页 |
| 2.2.3 乙酸鉴定 | 第22页 |
| 2.2.4 阻断乙酸合成 | 第22-23页 |
| 2.2.5 摇瓶发酵 | 第23页 |
| 2.2.6 3 -L发酵罐补料分批发酵 | 第23页 |
| 2.2.7 分析方法 | 第23-24页 |
| 2.3 结果 | 第24-30页 |
| 2.3.1 阻断副产物乙偶姻溢流对GlcNAc发酵的影响 | 第24-25页 |
| 2.3.2 阻断乙偶合成导致副产物乙酸溢流 | 第25-27页 |
| 2.3.3 添加碳酸钙对GlcNAc发酵的影响 | 第27-28页 |
| 2.3.4 恒pH补料分批发酵过程控制提高GlcNAc产量和转化率 | 第28-29页 |
| 2.3.5 阻断副产物乙酸溢流对GlcNAc发酵的影响 | 第29-30页 |
| 2.4 讨论 | 第30-31页 |
| 2.5 本章小结 | 第31-34页 |
| 第三章 强化关键酶表达疏导碳代谢流至GlcNAc合成模块 | 第34-52页 |
| 3.1 前言 | 第34-35页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第35-44页 |
| 3.2.1 菌株、质粒和培养条件 | 第35页 |
| 3.2.2 关键酶CeGNA1 N端标签融合 | 第35-41页 |
| 3.2.3 关键酶CeGNA1 RBS优化 | 第41-42页 |
| 3.2.4 关键酶EcGlmS在alsRSD位点整合表达 | 第42-43页 |
| 3.2.5 mRNA稳定子调控关键酶EcGlmS表达 | 第43页 |
| 3.2.6 分析方法 | 第43-44页 |
| 3.3 结果 | 第44-50页 |
| 3.3.1 提高关键酶CeGNA1表达促进丙酮酸利用和GlcNAc积累 | 第44-46页 |
| 3.3.2 RBS优化对GlcNAc发酵及关键酶CeGNA1表达的影响 | 第46-47页 |
| 3.3.3 整合表达关键酶EcGlmS促进碳代谢流向GlcNAc合成途径 | 第47-48页 |
| 3.3.4 关键酶EcGlmS 5’端融合mRNA稳定子对GlcNAc发酵的影响 | 第48-50页 |
| 3.4 讨论 | 第50-51页 |
| 3.5 本章小结 | 第51-52页 |
| 第四章 宿主细胞性能提升辅助途径酶工程疏导碳代谢流至GlcNAc合成模块 | 第52-66页 |
| 4.1 前言 | 第52-53页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第53-58页 |
| 4.2.1 菌株、质粒和培养条件 | 第53页 |
| 4.2.2 胞内pH测定 | 第53-56页 |
| 4.2.3 关键酶CeGNA1随机突变 | 第56页 |
| 4.2.4 关键酶CeGNA1及其突变体纯化及酶活测定 | 第56-57页 |
| 4.2.5 脲酶在yoqM位点整合表达 | 第57页 |
| 4.2.6 补料分批发酵 | 第57页 |
| 4.2.7 分析方法 | 第57-58页 |
| 4.3 结果 | 第58-63页 |
| 4.3.1 丙酮酸积累对胞外pH和胞内pH稳态的影响 | 第58页 |
| 4.3.2 关键酶CeGNA1定向进化对GlcNAc发酵的影响 | 第58-61页 |
| 4.3.3 脲酶表达对胞内pH_(in)及GlcNAc发酵的影响 | 第61-63页 |
| 4.3.4 3 -L发酵罐补料分批发酵 | 第63页 |
| 4.4 讨论 | 第63-64页 |
| 4.5 本章小结 | 第64-66页 |
| 第五章 中心氮代谢优化促进合成培养基中GlcNAc积累 | 第66-79页 |
| 5.1 前言 | 第66-67页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第67-73页 |
| 5.2.1 菌株、质粒及培养条件 | 第67-72页 |
| 5.2.2 敲除内源谷氨酸脱氢酶编码基因gudB及rocG | 第72页 |
| 5.2.3 整合表达异源谷氨酸脱氢酶EcGDH | 第72页 |
| 5.2.4 整合表达NADH氧化酶 | 第72页 |
| 5.2.5 整合表达异源谷氨酸合成酶ScGOGAT | 第72页 |
| 5.2.6 分析方法 | 第72-73页 |
| 5.3 结果 | 第73-77页 |
| 5.3.1 阻断谷氨酸胞内降解途径对GlcNAc发酵的影响 | 第73-74页 |
| 5.3.2 异源表达谷氨酸脱氢酶对GlcNAc发酵的影响 | 第74-75页 |
| 5.3.3 异源表达NADH依赖型谷氨酸合成酶对GlcNAc发酵的影响 | 第75-77页 |
| 5.4 讨论 | 第77-78页 |
| 5.5 本章小结 | 第78-79页 |
| 主要结论及展望 | 第79-82页 |
| 主要结论 | 第79-80页 |
| 展望 | 第80-82页 |
| 论文创新点 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-95页 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间相关成果清单 | 第95页 |
