| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-23页 |
| 1.1 糖苷酶的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.1.1 糖苷酶 | 第14-15页 |
| 1.1.2 糖苷酶的分类 | 第15页 |
| 1.2 糖基化的研究进展 | 第15-20页 |
| 1.2.1 蛋白质糖基化概述及分类 | 第15-17页 |
| 1.2.2 去糖基化的分析方法 | 第17页 |
| 1.2.3 N-糖基化位点的研究 | 第17-19页 |
| 1.2.4 O-糖基化位点的研究 | 第19-20页 |
| 1.2.5 质谱在糖基化位点鉴定中的应用 | 第20页 |
| 1.3 自溶素的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.4 固定化酶的应用 | 第21-22页 |
| 1.5 研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 第二章 糖苷酶基因的克隆与生物信息学分析 | 第23-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第23页 |
| 2.1.1 材料与菌株 | 第23页 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 | 第23页 |
| 2.1.3 主要溶液的配置 | 第23页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-28页 |
| 2.2.1 引物的设计 | 第23-24页 |
| 2.2.2 基因组DNA的提取 | 第24页 |
| 2.2.3 目的基因的克隆 | 第24-26页 |
| 2.2.4 质粒的提取和双酶切 | 第26页 |
| 2.2.5 目的基因与载体的连接 | 第26-27页 |
| 2.2.6 阳性菌落的鉴定 | 第27页 |
| 2.2.7 生物信息学分析 | 第27-28页 |
| 2.3 实验结果 | 第28-33页 |
| 2.3.1 目的基因的克隆 | 第28-29页 |
| 2.3.2 重组表达载体的构建 | 第29页 |
| 2.3.3 EndoEf和EndoE的氨基酸序列分析和多序列比对结果 | 第29-31页 |
| 2.3.4 OglyEf的氨基酸序列分析和多序列比对结果 | 第31-32页 |
| 2.3.5 AutoEfm的氨基酸序列分析和多序列比对结果 | 第32-33页 |
| 2.4 讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 糖苷酶的重组表达和纯化 | 第35-42页 |
| 3.1 实验材料 | 第35页 |
| 3.1.1 材料与菌株 | 第35页 |
| 3.1.2 工具酶和试剂 | 第35页 |
| 3.1.3 主要溶液的配置 | 第35页 |
| 3.2 实验方法 | 第35-37页 |
| 3.2.1 重组质粒的转化 | 第35页 |
| 3.2.2 目标蛋白的诱导表达 | 第35页 |
| 3.2.3 SDS-PAGE | 第35-36页 |
| 3.2.4 目标蛋白的可溶性分析 | 第36页 |
| 3.2.5 目标蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| 3.3 实验结果 | 第37-40页 |
| 3.3.1 目标蛋白的诱导表达及可溶性分析 | 第37-38页 |
| 3.3.2 目标蛋白的纯化 | 第38-40页 |
| 3.4 讨论 | 第40-42页 |
| 第四章 内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性及催化特性的分析 | 第42-57页 |
| 4.1 实验材料 | 第42页 |
| 4.1.1 工具酶和试剂 | 第42页 |
| 4.1.2 主要溶液的配置 | 第42页 |
| 4.2 实验方法 | 第42-46页 |
| 4.2.1 EndoEf活性的测定 | 第42-43页 |
| 4.2.2 EndoE活性的测定 | 第43页 |
| 4.2.3 EndoEf酶学性质的分析 | 第43页 |
| 4.2.4 EndoE酶学性质的分析 | 第43页 |
| 4.2.5 EndoEf的定点突变 | 第43-45页 |
| 4.2.6 EndoEf突变体酶活性的测定 | 第45页 |
| 4.2.7 MALDI-TOF质谱鉴定EndoEf对RNaseB糖链的水解 | 第45页 |
| 4.2.8 EndoEf的固定化 | 第45-46页 |
| 4.2.9 固定化EndoEf活性的测定 | 第46页 |
| 4.3 实验结果 | 第46-55页 |
| 4.3.1 EndoEf活性的分析 | 第46-47页 |
| 4.3.2 EndoE活性的分析 | 第47-48页 |
| 4.3.3 EndoEf酶学性质的分析 | 第48-51页 |
| 4.3.4 EndoE酶学性质的分析 | 第51-53页 |
| 4.3.5 EndoEf关键氨基酸残基突变分析 | 第53-54页 |
| 4.3.6 MALDI-TOF-MS鉴定EndoEf对RNaseB糖链的水解 | 第54页 |
| 4.3.7 EndoEf的固定化 | 第54-55页 |
| 4.4 讨论 | 第55-57页 |
| 第五章 内切-α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶活性及催化特性的分析 | 第57-64页 |
| 5.1 实验材料 | 第57页 |
| 5.1.1 工具酶和试剂 | 第57页 |
| 5.1.2 主要溶液的配置 | 第57页 |
| 5.2 实验方法 | 第57-59页 |
| 5.2.1 PNP标准曲线的制作 | 第57-58页 |
| 5.2.2 OglyEf活性的测定 | 第58页 |
| 5.2.3 OglyEf酶学性质的分析 | 第58页 |
| 5.2.4 OglyEf动力学参数的测定 | 第58-59页 |
| 5.3 实验结果 | 第59-62页 |
| 5.3.1 PNP标准曲线的制作 | 第59页 |
| 5.3.2 OglyEf活性的分析 | 第59页 |
| 5.3.3 反应时间对OglyEf活性的影响 | 第59-60页 |
| 5.3.4 温度和pH对OglyEf活性的影响 | 第60-61页 |
| 5.3.5 金属离子对OglyEf活性的影响 | 第61页 |
| 5.3.6 DTT、SDS和TritonX-100对OglyEf活性的影响 | 第61-62页 |
| 5.3.7 OglyEf的动力学参数 | 第62页 |
| 5.4 讨论 | 第62-64页 |
| 第六章 自溶素活性及催化特性的分析 | 第64-70页 |
| 6.1 实验材料 | 第64页 |
| 6.1.1 工具酶和试剂 | 第64页 |
| 6.1.2 主要溶液的配置 | 第64页 |
| 6.2 实验方法 | 第64-66页 |
| 6.2.1 AutoEfm截短体的重组表达和纯化 | 第64-65页 |
| 6.2.2 AutoEfm底物的制备 | 第65页 |
| 6.2.3 复性蛋白电泳法测定AutoEfm和截短体活性 | 第65页 |
| 6.2.4 抑菌圈法测定AutoEfm和截短体活性 | 第65页 |
| 6.2.5 比色法测定AutoEfmΔN+C活性 | 第65页 |
| 6.2.6 AutoEfmΔN+C酶学性质的分析 | 第65-66页 |
| 6.3 实验结果 | 第66-69页 |
| 6.3.1 复性SDS-PAGE法分析AutoEfm和截短体活性 | 第66页 |
| 6.3.2 抑菌圈法分析AutoEfm和截短体活性 | 第66-67页 |
| 6.3.3 比色法分析AutoEfmΔN+C活性 | 第67页 |
| 6.3.4 反应时间对AutoEfmΔN+C活性的影响 | 第67页 |
| 6.3.5 温度和pH对AutoEfmΔN+C活性的影响 | 第67-68页 |
| 6.3.6 金属离子对AutoEfmΔN+C活性的影响 | 第68-69页 |
| 6.4 讨论 | 第69-70页 |
| 第七章 结论与展望 | 第70-71页 |
| 7.1 结论 | 第70页 |
| 7.2 展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-79页 |
| 附录 | 第79-85页 |
| 缩略词 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 作者简介 | 第87页 |
