| 摘要 | 第5-8页 |
| abstract | 第8-10页 |
| 第一章 绪论 | 第16-27页 |
| 1.1 研究背景 | 第16页 |
| 1.2 丹参酮生物合成的研究概况 | 第16-18页 |
| 1.2.1 丹参酮生物合成途径的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.2 CPS、KSL基因的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.2.3 SmCPS1与SmKSL1是丹参酮生物合成中的关键基因 | 第18页 |
| 1.3 植物代谢调控的方式及研究进展 | 第18-20页 |
| 1.4 植物中转录调控研究的技术与应用 | 第20-22页 |
| 1.4.1 酵母单杂交技术在植物转录调控研究中的应用 | 第21页 |
| 1.4.2 蛋白凝胶迁移率(EMSA)在植物转录调控研究中的应用 | 第21页 |
| 1.4.3 染色体免疫共沉淀技术(ChIP)及其相关技术在植物转录调控研究中的应用 | 第21-22页 |
| 1.5 转录因子在药用植物次生代谢中的研究现状 | 第22-23页 |
| 1.6 现代植物基因功能研究的方法与展望 | 第23-25页 |
| 1.6.1 植物基因超表达在转录因子功能中的研究与应用 | 第23页 |
| 1.6.2 人工microRNA干扰植物基因功能的研究与应用 | 第23-24页 |
| 1.6.3 植物功能研究技术的发展与展望 | 第24-25页 |
| 1.7 研究内容 | 第25页 |
| 1.8 研究的目的与意义 | 第25-26页 |
| 1.9 研究的技术路线 | 第26-27页 |
| 第二章 SmCPS1与SmKSL1的亚细胞定位以及其基因与丹参酮合成的关系 | 第27-41页 |
| 2.1 引言 | 第27页 |
| 2.2 实验材料与试剂 | 第27-28页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第27页 |
| 2.2.2 菌株与载体的构建 | 第27页 |
| 2.2.3 实验试剂与耗材 | 第27-28页 |
| 2.3 仪器 | 第28页 |
| 2.4 试验方法与步骤 | 第28-36页 |
| 2.4.1 HPLC检测丹参酮的含量 | 第28页 |
| 2.4.2 SmCPS1与SmKSL1的亚细胞定位 | 第28-35页 |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 | 第35-36页 |
| 2.4.4 数据统计与分析 | 第36页 |
| 2.5 结果与分析 | 第36-40页 |
| 2.5.1 不同产地丹参的丹参酮含量存在差异 | 第36-37页 |
| 2.5.2 SmCPS1与SmKSL1基因与丹参酮的含量之间有的相关性分析 | 第37-38页 |
| 2.5.3 SmCPS1与SmKSL1的亚细胞定位载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.5.4 SmCPS1与SmKSL1的亚细胞定位结果分析 | 第39-40页 |
| 2.6 讨论 | 第40页 |
| 2.6.1 SmCPS1与SmKSL1是丹参酮生物合成的关键基因 | 第40页 |
| 2.6.2 SmCPS1与SmKSL1定位于细胞内的质体内 | 第40页 |
| 小结 | 第40-41页 |
| 第三章 SmCPS1与SmKSL1基因启动子的扩增与分析 | 第41-52页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第41页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第41页 |
| 3.2.2 实验仪器与试剂 | 第41页 |
| 3.3 试验方法 | 第41-46页 |
| 3.3.1 丹参总DNA的提取 | 第41-42页 |
| 3.3.2 SmCPS1基因启动子的克隆 | 第42页 |
| 3.3.3 SmKSL1基因启动子的克隆 | 第42-43页 |
| 3.3.4 SmCPS1与SmKSL1启动子分析 | 第43页 |
| 3.3.5 SmCPS1与SmKSL1启动子活性的鉴定 | 第43-45页 |
| 3.3.6 SmCPS1与SmKSL1启动子对外源GA与ETH的响应的研究 | 第45页 |
| 3.3.7 GUS活性的定量检测 | 第45-46页 |
| 3.3.8 数据统计与分析 | 第46页 |
| 3.4 结果与分析 | 第46-50页 |
| 3.4.1 SmCPS1与SmKSL1启动子的克隆 | 第46-47页 |
| 3.4.2 SmCPS1与SmKSL1启动子结构与作用元件的分析 | 第47-48页 |
| 3.4.3 SmCPS1与SmKSL1启动子活性分析 | 第48-49页 |
| 3.4.4 SmCPS1与SmKSL1启动子特异性响应外源GA与Eth信号分析 | 第49-50页 |
| 3.5 讨论 | 第50-51页 |
| 3.5.1 SmCPS1与SmKSL1启动子获得与顺式作用元件的预测分析 | 第50-51页 |
| 3.5.2 SmCPS1与SmKSL1启动子活性以及对外源GA、ETH处理响应验证 | 第51页 |
| 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 Y1H筛选特异性识别SmCPS1与SmKSL1启动子区的转录因子及其与靶位序列的互作验证 | 第52-76页 |
| 4.1 引言 | 第52-53页 |
| 4.2 实验仪器 | 第53页 |
| 4.3 实验材料与方法 | 第53-67页 |
| 4.3.1 细菌与酵母株系 | 第53页 |
| 4.3.2 丹参总RNA的提取 | 第53页 |
| 4.3.3 丹参cDNA文库的构建 | 第53-55页 |
| 4.3.4 利用Y1H体系进行丹参cDNA文库的筛选 | 第55-57页 |
| 4.3.5 酵母单杂交的在丹参cDNA文库中筛选转录因子 | 第57-59页 |
| 4.3.6 酵母质粒的提取 | 第59页 |
| 4.3.7 转录因子全长的获得 | 第59-60页 |
| 4.3.8 获得转录因子的Y1H互作验证 | 第60-61页 |
| 4.3.9 β-X-gal显色反应 | 第61页 |
| 4.3.10 SmERF6与SmERF8蛋白的获得 | 第61-66页 |
| 4.3.11 凝胶迁移率(EMSA)验证SmERF6与SmERF8蛋白与靶位序列互作 | 第66-67页 |
| 4.4 实验结果与分析 | 第67-73页 |
| 4.4.1 诱饵载体的构建,酵母株系的鉴定以及AbA抑制浓度的确定 | 第67-68页 |
| 4.4.2 丹参cDNA文库的筛选 | 第68-69页 |
| 4.4.3 SmERF6与SmERF8转录因子的克隆与体内互作验证 | 第69-70页 |
| 4.4.4 Pmal-2X-SmERF6与Pmal-2X-SmERF8载体构建成功 | 第70页 |
| 4.4.5 SmERF6与SmERF8蛋白诱导表达以及WesternBlotting验证 | 第70-72页 |
| 4.4.6 SmERF6、SmERF8蛋白与SmCPS1、SmKSL1基因启动子上的GCC-box作用元件结合 | 第72-73页 |
| 4.5 讨论 | 第73-74页 |
| 4.5.1 利用SmCPS1与SmKSL1启动子作为诱饵在丹参cDNA文库内成功筛选出10条ERF家族转录因子 | 第73页 |
| 4.5.2 SmERF6与SmERF8是潜在的丹参酮生物合成调控的关键因子 | 第73-74页 |
| 4.5.3 标签蛋白MBP以及带有MBP标签的SmERF6与SmERF8蛋白在大肠杆菌Rossetta菌株内被成功诱导表达 | 第74页 |
| 4.5.4 SmERF6与SmERF8蛋白特异性的与SmCPS1与SmKSL1基因启动子上的GCC-box结合 | 第74页 |
| 小结 | 第74-76页 |
| 第五章 SmERF6与SmERF8转录因子的结构分析,特异性表达以及亚细胞定位分析 | 第76-86页 |
| 5.1 引言 | 第76-77页 |
| 5.2 试剂与仪器 | 第77页 |
| 5.3 材料与方法 | 第77-80页 |
| 5.3.1 SmERF6与SmERF8生物信息学预测分析 | 第77页 |
| 5.3.2 SmERF6与SmERF8组织特异性表达分析 | 第77页 |
| 5.3.3 SmERF6与SmERF8对外源Eth与GA响应的处理 | 第77-78页 |
| 5.3.4 SmERF6与SmERF8亚细胞定位分析 | 第78-80页 |
| 5.3.5 数据统计与分析 | 第80页 |
| 5.4 结果与分析 | 第80-85页 |
| 5.4.1 SmERF6与SmERF8的结构特性分析 | 第80-82页 |
| 5.4.2 SmERF6与SmERF8在丹参中的组织特异性表达分析 | 第82页 |
| 5.4.3 SmERF6与SmERF8对外源GA与Eth处理的响应 | 第82-83页 |
| 5.4.4 SmERF6与SmERF8的亚细胞定位分析 | 第83-85页 |
| 5.5 讨论 | 第85页 |
| 5.5.1 SmERF6与SmERF8具有典型的ERF基因的结构并对外源GA与Eth信号敏感 | 第85页 |
| 5.5.2 SmERF6与SmERF8分别在丹参的根、芦头内高表达并且定位于细胞的核内 | 第85页 |
| 小结 | 第85-86页 |
| 第六章 转录因子SmERF6与SmERF8的功能分析 | 第86-101页 |
| 6.1 引言 | 第86页 |
| 6.2 实验所用仪器 | 第86页 |
| 6.3 实验材料与方法 | 第86-91页 |
| 6.3.1 丹参无菌苗的培养与继代 | 第86-87页 |
| 6.3.2 PCAMBIA1304+-SmERF6与PCAMBIA1304+-SmERF8载体的构建 | 第87-88页 |
| 6.3.3 发根农杆菌ATCC15834感受态的制备及其PCAMBIA1304+-SmERF6与PCAMBIA1304+-SmERF8的转化 | 第88页 |
| 6.3.4 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根以及空载体PCAMBIA1304+毛状根的诱导 | 第88-89页 |
| 6.3.5 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根的获得以及阳性株系的鉴定 | 第89-90页 |
| 6.3.6 qRT-PCR测定 | 第90页 |
| 6.3.7 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根内丹参酮,总酚酸以及总黄酮含量变化的测定 | 第90页 |
| 6.3.8 过表达SmERF6与SmERF8丹参毛状根鲜重变化的测定 | 第90-91页 |
| 6.3.9 数据统计与分析 | 第91页 |
| 6.4 结果与分析 | 第91-97页 |
| 6.4.1 PCAMBIA1304+-SmERF6与PCAMBIA1304+-SmERF8的过表达载体构建成功 | 第91-92页 |
| 6.4.2 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根的成功诱导并获得阳性株系 | 第92-93页 |
| 6.4.3 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根内当SmERF6、SmERF8基因表达量上升时关键靶基因SmCPS1、SmKSL1被诱导表达 | 第93-94页 |
| 6.4.4 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根丹参酮含量明显升高 | 第94-95页 |
| 6.4.5 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根总酚酸与总黄酮含量显著下降 | 第95页 |
| 6.4.6 过表达SmERF6、SmERF8转基因毛状根生长受到抑制 | 第95-97页 |
| 6.5 讨论 | 第97-100页 |
| 6.5.1 过表达SmERF6可以诱发靶基因SmCPS1与SmKSL1的转录水平进而促进丹参酮的合成与积累 | 第97-98页 |
| 6.5.2 SmERF8通过提高靶基因SmKSL1的转录表达水平促进丹参酮生物合成 | 第98页 |
| 6.5.3 在过表达SmERF6、SmERF8的丹参毛状根株系中总酚酸、总黄酮与丹参酮代谢之间存在内稳态调节 | 第98-99页 |
| 6.5.4 在过表达SmERF6、SmERF8抑制了丹参毛状根的生长 | 第99-100页 |
| 小结 | 第100-101页 |
| 第七章 人工microRNA的合成以及靶基因沉默分析 | 第101-111页 |
| 7.1 引言 | 第101页 |
| 7.2 实验所用仪器 | 第101页 |
| 7.3 实验材料与方法 | 第101-104页 |
| 7.3.1 丹参无菌苗的培养与继代培养 | 第101页 |
| 7.3.2 人工amiRSmERF6与amiRSmERF8的筛选与确定 | 第101页 |
| 7.3.3 PCAMBIA1304-amiRSmERF6与PCAMBIA1304-amiRSmERF8载体的构建 | 第101-102页 |
| 7.3.4 发根农杆菌ATCC15834感受态的制备及其PCAMBIA1304-amiRSmERF6与PCAMBIA1304-amiRSmERF8的转化 | 第102页 |
| 7.3.5 转基因毛状根的诱导 | 第102页 |
| 7.3.6 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8转基因毛状根的获得以及阳性株系的鉴定 | 第102-103页 |
| 7.3.7 miRNA的提取与分离 | 第103页 |
| 7.3.8 microRNA第一链cDNA合成 | 第103页 |
| 7.3.9 amiRSmERF6与amiRSmERF8的定量分析 | 第103-104页 |
| 7.3.10 SmERF6,SmERF8与靶基因SmCPS1、SmKSL1的实时荧光定量分析 | 第104页 |
| 7.3.11 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8转基因毛状根内丹参酮,总酚酸以及总黄酮含量变化的测定 | 第104页 |
| 7.3.12 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8丹参毛状根鲜重变化的测定 | 第104页 |
| 7.3.13 数据统计与分析 | 第104页 |
| 7.4 结果与分析 | 第104-109页 |
| 7.4.1 amiRSmERF6与amiRSmERF8的选取与分离 | 第104-105页 |
| 7.4.2 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8丹参转基因毛状根的鉴定 | 第105-106页 |
| 7.4.3 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8在丹参的毛状根中对SmERF6、SmERF8、SmCPS1与SmKSL1基因表达水平表达的影响 | 第106-107页 |
| 7.4.4 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8对丹参毛状根丹参酮含量的影响 | 第107-108页 |
| 7.4.5 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8对丹参毛状根总酚酸、总黄酮含量以及毛状根的生长均无显著影响 | 第108-109页 |
| 7.5 讨论 | 第109-110页 |
| 7.5.1 人工合成的amiRSmERF6与amiRSmERF8成功的干扰了SmERF6与SmERF8基因的表达并影响了丹参酮合成 | 第109页 |
| 7.5.2 过表达amiRSmERF6与amiRSmERF8导致丹参酮的含量下降,而对酚酸、黄酮类物质以及毛状根的生长无显著影响 | 第109-110页 |
| 小结 | 第110-111页 |
| 第八章 SmGRAS1～5基因的克隆与特性分析 | 第111-125页 |
| 8.1 引言 | 第111-112页 |
| 8.2 材料与方法 | 第112-114页 |
| 8.2.1 植物材料和生长条件 | 第112页 |
| 8.2.2 SmGRAS基因的基因克隆和生物信息学分析 | 第112-113页 |
| 8.2.3 SmGRAS基因的RNA分离和定量RT-PCR分析 | 第113页 |
| 8.2.4 高效液相色谱分析 | 第113页 |
| 8.2.5 数据统计和分析 | 第113-114页 |
| 8.3 结果与分析 | 第114-121页 |
| 8.3.1 丹参SmGRASs的序列特征 | 第114页 |
| 8.3.2 丹参SmGRAS蛋白的系统进化分析和结构功能预测 | 第114-116页 |
| 8.3.3 SmGRAS1-5基因的组织特异性表达水平 | 第116-117页 |
| 8.3.4 SmGRAS1~5、SmCPS1和SmKSL1基因对外源GA处理的响应情况 | 第117页 |
| 8.3.5 SmGRAS1-5、SmCPS1和SmKSL1基因对外源Eth处理的响应情况 | 第117-121页 |
| 8.3.6 外源性GA与Eth处理丹参毛状根促进DT-I,T-I与T-IIA的积累,但CT对其不敏感 | 第121页 |
| 8.4 讨论 | 第121-123页 |
| 8.4.1 SmGRAS1-5基因是丹参中潜在参与植物激素合成调控的转录因子 | 第121-122页 |
| 8.4.2 SmGRAS1-5基因是潜在的参与GA与ET信号调控的转录因子 | 第122页 |
| 8.4.3 SmGRAS1-5基因是潜在的参与丹参酮生物合成调控的转录因子 | 第122-123页 |
| 小结 | 第123-125页 |
| 结论 | 第125-127页 |
| 创新点 | 第127-128页 |
| 展望 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-142页 |
| 附录 | 第142-149页 |
| 致谢 | 第149-150页 |
| 作者简介 | 第150-151页 |
