| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 第一章 综述石杉碱生物合成与代谢途径研究进展 | 第14-18页 |
| 引言 | 第14页 |
| 1.1 石杉碱甲生源关系及其分子结构 | 第14-15页 |
| 1.2 课题研究背景 | 第15-16页 |
| 1.3 石杉碱甲的生物合成与代谢调控的关键限速酶(基因)的选择 | 第16-17页 |
| 1.3.1 赖氨酸脱羧酶简介 | 第16页 |
| 1.3.2 细胞色素P450(CYP450)简介 | 第16页 |
| 1.3.3 甲基转移酶(MTs)简介 | 第16-17页 |
| 1.3.4 加双氧酶简介 | 第17页 |
| 1.4 课题的任务 | 第17-18页 |
| 第二章 四种石杉科植物L-赖氨酸脱羧酶基因的克隆及分析 | 第18-42页 |
| 引言 | 第18页 |
| 2.1 试验材料 | 第18-22页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第18页 |
| 2.1.2 菌株 | 第18-19页 |
| 2.1.3 仪器及设备 | 第19-20页 |
| 2.1.4 购买试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.5 自配标准试剂 | 第21-22页 |
| 2.2 试验方法和步骤 | 第22-36页 |
| 2.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取 | 第22-24页 |
| 2.2.1.1 提取RNA的准备工作 | 第22页 |
| 2.2.1.2 提取RNA步骤 | 第22-24页 |
| 2.2.1.3 提取RNA浓度及纯度的测定 | 第24页 |
| 2.2.2 四种石杉科植物总RNA的反转录成cDNA | 第24-25页 |
| 2.2.3 四种石杉科植物L-lysine decarboxy lase基因扩增 | 第25-30页 |
| 2.2.3.1 L-lysine decarboxy lase基因扩增体系反应物水平正交优化 | 第25-27页 |
| 2.2.3.2 反应退火温度的优化 | 第27-29页 |
| 2.2.3.3 反应程序循环数的优化 | 第29页 |
| 2.2.3.4 优化体系及退火温度后四种石杉科植物L-赖氨酸脱羧酶基因的扩增 | 第29-30页 |
| 2.2.4 割胶纯化回收目的DNA片段操作步骤 | 第30-31页 |
| 2.2.5 PCR产物与载体的连接 | 第31-32页 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| 2.2.7 连接反应产物的转化 | 第33-34页 |
| 2.2.8 筛选及验证含插入片段的转化子 | 第34-36页 |
| 2.2.8.1 包含插入片段质粒的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.8.2 含插入基因质粒的验证 | 第35-36页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第36-40页 |
| 2.3.1 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因优化结果的讨论 | 第36-37页 |
| 2.3.1.1 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因反应物正交优化结果的讨论 | 第36页 |
| 2.3.1.2 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因程序退火温度优化结果的讨论 | 第36-37页 |
| 2.3.1.3 对扩增L-赖氨酸脱羧酶基因程序反应循环数优化结果的讨论 | 第37页 |
| 2.3.2 对感受态细胞制备实验的讨论 | 第37页 |
| 2.3.3 各材料赖氨酸脱羧酶基因核酸序列的Blast比对结果及系统发生构建 | 第37-38页 |
| 2.3.3.1 各材料L-赖氨酸脱羧酶的nucleotide blast下的blastn比对 | 第37页 |
| 2.3.3.2 各材料赖氨酸脱羧酶基因核酸序列系统发生树分析 | 第37-38页 |
| 2.3.4 各材料赖氨酸脱羧酶基因氨基酸序列Blastx比对结果及系统发生构建 | 第38-40页 |
| 2.3.4.1 各材料L-赖氨酸脱羧酶的nucleotide blast下的blastx比对 | 第38-40页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 四种石杉科植物细胞色素P450基因的克隆及分析 | 第42-59页 |
| 引言 | 第42页 |
| 3.1 试验材料 | 第42-43页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第42页 |
| 3.1.2 菌株 | 第42页 |
| 3.1.3 仪器及设备 | 第42页 |
| 3.1.4 购买试剂 | 第42页 |
| 3.1.5 自配标准试剂 | 第42-43页 |
| 3.2 试验方法和步骤 | 第43-55页 |
| 3.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取 | 第43页 |
| 3.2.2 四种石杉科植物总RNA反转录成cDNA | 第43页 |
| 3.2.3 四种石杉科植物细胞色素71A_1基因的扩增 | 第43-44页 |
| 3.2.4 四种石杉科植物细胞色素72A_1基因的扩增 | 第44页 |
| 3.2.5 四种石杉科植物细胞色素90A基因的扩增 | 第44-48页 |
| 3.2.6 细胞色素Cyp450-71A_1基因扩增反应体系退火温度的优化 | 第48-49页 |
| 3.2.7 细胞色素Cyp450-71A_1基因优化反应体系扩增 | 第49-50页 |
| 3.2.8 细胞色素Cyp450-72A_1基因扩增反应体系退火温度的优化 | 第50-51页 |
| 3.2.9 细胞色素Cyp450-72A_1基因优化反应体系扩增 | 第51页 |
| 3.2.10 细胞色素Cyp450-90A基因扩增反应体系退火温度的优化 | 第51-52页 |
| 3.2.11 细胞色素Cyp450-90A基因优化反应体系扩增 | 第52-53页 |
| 3.2.12 目的DNA片段的割胶纯化回收 | 第53页 |
| 3.2.13 目的片段与载体的连接 | 第53页 |
| 3.2.14 感受态细胞的制备 | 第53页 |
| 3.2.15 连接反应产物的转化 | 第53-54页 |
| 3.2.16 筛选及验证含插入片段的转化子 | 第54-55页 |
| 3.2.16.1 包含插入片段质粒的提取 | 第54页 |
| 3.2.16.2 含插入基因质粒的验证 | 第54-55页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第55-58页 |
| 3.3.1 各材料细胞色素P450基因核酸序列的Blast比对结果及系统发生构建 | 第55-56页 |
| 3.3.1.1 各材料细胞色素P450基因的nucleotide blast下的blastn比对 | 第55页 |
| 3.3.1.2 各材料细胞色素P450基因基因核酸序列系统发生树分析 | 第55-56页 |
| 3.3.2 各材料细胞色素P450氨基酸序列的Blast比对结果及系统发生构建 | 第56-58页 |
| 3.3.2.1 各材料细胞色素P450-71A1的blastx比对及系统发生构建 | 第56-57页 |
| 3.3.2.2 各材料细胞色素P450-72A1的blastx比对及系统发生构建 | 第57页 |
| 3.3.2.3 各材料细胞色素P450-90A的blastx比对及系统发生构建 | 第57-58页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第58-59页 |
| 第四章 四种石杉科植物加双氧酶基因的克隆及分析 | 第59-66页 |
| 引言 | 第59页 |
| 4.1 试验材料 | 第59-60页 |
| 4.1.1 植物材料 | 第59页 |
| 4.1.2 菌株 | 第59页 |
| 4.1.3 仪器及设备 | 第59页 |
| 4.1.4 购买试剂 | 第59页 |
| 4.1.5 自配标准试剂 | 第59-60页 |
| 4.2 试验方法和步骤 | 第60-65页 |
| 4.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取 | 第60页 |
| 4.2.2 四种石杉科植物总RNA的反转录成cDNA | 第60页 |
| 4.2.3 加双氧酶基因的扩增正交优化 | 第60-62页 |
| 4.2.4 加双氧酶基因扩增反应体系退火温度的优化 | 第62-63页 |
| 4.2.5 加双氧酶基因优化反应体系扩增 | 第63-64页 |
| 4.2.6 目的DNA片段的割胶纯化回收 | 第64页 |
| 4.2.7 目的片段与载体的连接 | 第64页 |
| 4.2.8 感受态细胞的制备 | 第64页 |
| 4.2.9 连接反应产物的转化 | 第64页 |
| 4.2.10 筛选及验证含插入片段的转化子 | 第64-65页 |
| 4.2.10.1 包含插入片段质粒的提取 | 第64页 |
| 4.2.10.2 含插入基因质粒的验证 | 第64-65页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第65-66页 |
| 4.3.1 各材料加双氧酶序列的Blast比对及系统发生的构建 | 第65页 |
| 4.3.2 对加双氧酶序列的比对结果的讨论 | 第65-66页 |
| 第五章 四种石杉科植物甲基转移酶基因的克隆及分析 | 第66-74页 |
| 引言 | 第66页 |
| 5.1 试验材料 | 第66-67页 |
| 5.1.1 植物材料 | 第66页 |
| 5.1.2 菌株 | 第66页 |
| 5.1.3 仪器及设备 | 第66页 |
| 5.1.4 购买试剂 | 第66页 |
| 5.1.5 自配标准试剂 | 第66-67页 |
| 5.2 试验方法和步骤 | 第67-72页 |
| 5.2.1 四种石杉科植物总RNA的提取 | 第67页 |
| 5.2.2 四种石杉科植物总RNA的反转录成cDNA | 第67页 |
| 5.2.3 四种石杉科植物甲基转移酶基因的扩增 | 第67-69页 |
| 5.2.4 甲基转移酶基因扩增反应体系退火温度的优化 | 第69-70页 |
| 5.2.5 甲基转移酶基因优化反应体系扩增 | 第70-71页 |
| 5.2.6 目的DNA片段的割胶纯化回收 | 第71页 |
| 5.2.7 目的片段与载体的连接 | 第71页 |
| 5.2.8 感受态细胞的制备 | 第71页 |
| 5.2.9 连接反应产物的转化 | 第71页 |
| 5.2.10 筛选及验证含插入片段的转化子 | 第71-72页 |
| 5.2.10.1 包含插入片段质粒的提取 | 第71页 |
| 5.2.10.2 含插入基因质粒的验证 | 第71-72页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第72-73页 |
| 5.3.1 对扩增甲基转移酶基因优化结果的讨论 | 第72页 |
| 5.3.2 各材料甲基转移酶基因序列的Blast比对结果及系统发生构建 | 第72-73页 |
| 5.3.2.1 各材料甲基转移酶基因的nucleotide blast下的blastn比对 | 第72页 |
| 5.3.2.2 各材料甲基转移酶的blastx比对 | 第72-73页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第73-74页 |
| 第六章 华南马尾杉及有柄马尾杉石杉碱生物合成途径中关键酶基因的荧光定量分析 | 第74-82页 |
| 引言 | 第74页 |
| 6.1 试验材料 | 第74-75页 |
| 6.1.1 植物材料 | 第74页 |
| 6.1.2 仪器设备及耗材 | 第74页 |
| 6.1.3 购买试剂 | 第74-75页 |
| 6.1.4 自配标准试剂 | 第75页 |
| 6.2 试验方法和步骤 | 第75-78页 |
| 6.2.1 华南马尾杉与有柄马尾杉总RNA的提取 | 第75页 |
| 6.2.1.1 提取RNA的准备工作 | 第75页 |
| 6.2.1.2 提取RNA步骤 | 第75页 |
| 6.2.1.3 提取RNA浓度及纯度的测定 | 第75页 |
| 6.2.2 华南马尾杉与有柄马尾杉总RNA的反转录成cDNA | 第75页 |
| 6.2.3 荧光定量PCR引物设计 | 第75-77页 |
| 6.2.3.1 关键酶基因引物设计原则 | 第75-76页 |
| 6.2.3.2 内参基因引物的设计 | 第76页 |
| 6.2.3.3 关键酶基因引物的设计 | 第76-77页 |
| 6.2.4 华南马尾杉与有柄马尾杉关键酶基因的荧光定量分析 | 第77-78页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第78-81页 |
| 6.3.1 荧光定量PCR结果分析 | 第78-79页 |
| 6.3.1.1 L-赖氨酸脱羧酶基因荧光定量PCR结果分析 | 第78页 |
| 6.3.1.2 Cytochrome P450 71A1基因荧光定量PCR结果分析 | 第78页 |
| 6.3.1.3 Cytochrome P450 72A1基因荧光定量PCR结果分析 | 第78页 |
| 6.3.1.4 加双氧酶基因荧光定量PCR结果分析 | 第78页 |
| 6.3.1.5 甲基转移酶基因荧光定量PCR结果分析 | 第78-79页 |
| 6.3.2 荧光定量PCR结果数值计算及分析 | 第79-81页 |
| 6.4 小结与讨论 | 第81-82页 |
| 第七章 长柄石杉LDB基因全长的调取 | 第82-91页 |
| 引言 | 第82页 |
| 7.1 试验材料 | 第82页 |
| 7.1.1 植物材料 | 第82页 |
| 7.1.2 菌株 | 第82页 |
| 7.1.3 仪器设备及耗材 | 第82页 |
| 7.1.4 购买试剂 | 第82页 |
| 7.1.5 自配标准试剂 | 第82页 |
| 7.2 试验方法和步骤 | 第82-86页 |
| 7.2.1 引物合成 | 第82-83页 |
| 7.2.2 L-赖氨酸脱羧酶基因5’race | 第83-85页 |
| 7.2.2.1 总RNA提取 | 第83页 |
| 7.2.2.2 cDNA第一条链的合成 | 第83页 |
| 7.2.2.3 TDT加尾反应 | 第83-84页 |
| 7.2.2.4 巢式PCR反应 | 第84-85页 |
| 7.2.3 L-赖氨酸脱羧酶基因3’race | 第85-86页 |
| 7.2.3.1 总RNA提取 | 第85页 |
| 7.2.3.2 cDNA第一条链的合成 | 第85页 |
| 7.2.3.3 巢式PCR反应 | 第85-86页 |
| 7.3 结果与讨论 | 第86-91页 |
| 7.3.1 长柄石杉LDB基因序列全长 | 第86-87页 |
| 7.3.2 长柄石杉LDB氨基酸序列全长 | 第87页 |
| 7.3.3 二级结构分析 | 第87-88页 |
| 7.3.4 三级结构分析 | 第88-91页 |
| 7.3.4.1 从63至242位氨基酸评价结果 | 第88页 |
| 7.3.4.2 从29至240位氨基酸评价结果 | 第88-91页 |
| 第八章 结论与展望 | 第91-94页 |
| 引言 | 第91页 |
| 8.1 石杉碱甲的生物合成及代谢调控可能途径描述 | 第91-92页 |
| 8.2 展望 | 第92-93页 |
| 8.3 本文创新点 | 第93页 |
| 8.4 需继续深入研究的课题项目 | 第93页 |
| 8.5 研究生期间参与的基金研究项目及发表的论文 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-99页 |
| 附录 | 第99-104页 |
| 致谢 | 第104页 |
