| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 缩略词和术语表 | 第10-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-31页 |
| 1.1 前言 | 第15页 |
| 1.2 链霉菌次级代谢产物的研究进展 | 第15-21页 |
| 1.2.1 聚酮化合物及聚酮合酶的研究进展 | 第15-18页 |
| 1.2.2 非核糖体肽和非核糖体肽合成酶的研究进展 | 第18-21页 |
| 1.3 磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的研究进展 | 第21-28页 |
| 1.3.1 PPTase的功能和分类 | 第21-24页 |
| 1.3.2 PPTase底物选择性的研究进展 | 第24-26页 |
| 1.3.3 PPTase的应用 | 第26-28页 |
| 1.4 纳他霉素生物合成研究进展 | 第28-29页 |
| 1.5 他克莫司生物合成的研究进展 | 第29-30页 |
| 1.6 本论文的研究内容及目的 | 第30-31页 |
| 第二章 恰塔努加链霉菌L10中PKS辅基化网络的研究与应用 | 第31-53页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 材料 | 第31-36页 |
| 2.2.1 菌株 | 第31-32页 |
| 2.2.2 本章所用质粒列表 | 第32-33页 |
| 2.2.3 本章所用引物 | 第33-34页 |
| 2.2.4 实验仪器及设备 | 第34-35页 |
| 2.2.5 试剂及试剂盒 | 第35页 |
| 2.2.6 培养基 | 第35-36页 |
| 2.3 方法 | 第36-42页 |
| 2.3.1 大肠杆菌质粒抽提 | 第36页 |
| 2.3.2 大肠杆菌Cosmid抽提 | 第36页 |
| 2.3.3 核酸片段割胶回收 | 第36页 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第37页 |
| 2.3.6 大肠杆菌中重组蛋白表达 | 第37页 |
| 2.3.7 大肠杆菌中重组蛋白纯化 | 第37-38页 |
| 2.3.8 链霉菌基因组提取 | 第38页 |
| 2.3.9 恰塔努加链霉菌L10孢子悬液的制备 | 第38页 |
| 2.3.10 恰塔努加链霉菌L10摇瓶发酵 | 第38-39页 |
| 2.3.11 恰塔努加链霉菌L10-大肠杆菌接合转导 | 第39页 |
| 2.3.12 PCR-targeting基因敲除 | 第39-40页 |
| 2.3.13 PPTase体外催化ACP的辅基化 | 第40-41页 |
| 2.3.14 HPLC分析ACP | 第41页 |
| 2.3.15 LC-MS分析ACP | 第41-42页 |
| 2.4 实验结果 | 第42-52页 |
| 2.4.1 分析恰塔努加链霉菌L10中的PPTase及PKS | 第42-44页 |
| 2.4.2 恰塔努加链霉菌L10中PPTase及底物ACP的异源生产 | 第44-46页 |
| 2.4.3 体外表征恰塔努加链霉菌中PPTase | 第46-48页 |
| 2.4.4 体内表征恰塔努加链霉菌L10中PPTase | 第48-50页 |
| 2.4.5 改造恰塔努加链霉菌L10中PKS辅基化网络 | 第50-52页 |
| 2.5 本章小结及讨论 | 第52-53页 |
| 第三章 筑波链霉菌YN06中PKS和NRPS辅基化网络的研究 | 第53-68页 |
| 3.1 引言 | 第53页 |
| 3.2 实验材料 | 第53-54页 |
| 3.2.1 质粒 | 第53-54页 |
| 3.2.2 菌株 | 第54页 |
| 3.2.3 培养基 | 第54页 |
| 3.3 实验方法 | 第54-56页 |
| 3.3.1 体外共表达体系的建立 | 第54-55页 |
| 3.3.2 筑波链霉菌YN06和大肠杆菌的属间结合转移 | 第55页 |
| 3.3.3 筑波链霉菌敲除株的获得 | 第55-56页 |
| 3.3.4 筑波链霉菌的发酵 | 第56页 |
| 3.3.5 筑波链霉菌发酵产物FK506的萃取和检测 | 第56页 |
| 3.4 实验结果 | 第56-67页 |
| 3.4.1 分析筑波链霉菌中的PPTase及PKS和NRPS | 第56-59页 |
| 3.4.2 体外表征筑波链霉菌中PPTase | 第59-66页 |
| 3.4.3 体内表征筑波链霉菌中PPTase | 第66-67页 |
| 3.5 本章小结和讨论 | 第67-68页 |
| 第四章 PPTase结构与功能的研究 | 第68-87页 |
| 4.1 引言 | 第68页 |
| 4.2 材料 | 第68-71页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第68-70页 |
| 4.2.2 引物 | 第70-71页 |
| 4.2.3 培养基 | 第71页 |
| 4.3 实验方法 | 第71-74页 |
| 4.3.1 蛋白定点突变体的构建 | 第71-73页 |
| 4.3.2 构建PPTase融合蛋白 | 第73-74页 |
| 4.3.3 PPTase同源性分析 | 第74页 |
| 4.3.4 其他分子生物学实验 | 第74页 |
| 4.4 结果及讨论 | 第74-86页 |
| 4.4.1 Hppt和Sppt的功能 | 第74-77页 |
| 4.4.2 Ⅱ型PPTase中镁离子结合残基对活性的影响 | 第77-82页 |
| 4.4.3 PPTase的N端和C端对底物选择性的影响 | 第82-86页 |
| 4.5 本章小结及讨论 | 第86-87页 |
| 第五章 Ⅱ型PPTase的进化研究 | 第87-99页 |
| 5.1 引言 | 第87页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第87-88页 |
| 5.2.1 PPTase的鉴定及序列的获得 | 第87页 |
| 5.2.2 进化树分析 | 第87页 |
| 5.2.3 同线性分析 | 第87-88页 |
| 5.3 实验结果 | 第88-98页 |
| 5.3.1 Ⅱ型PPTase的鉴定与分布 | 第88-89页 |
| 5.3.2 Ⅱ型PPTase镁离子结合残基的多变性分析 | 第89-92页 |
| 5.3.3 Ⅱ型PPTase同源性分析 | 第92-97页 |
| 5.3.4 Ⅱ型PPTase同线性分析 | 第97-98页 |
| 5.4 本章小结及讨论 | 第98-99页 |
| 第六章 总结和展望 | 第99-101页 |
| 6.1 论文总结 | 第99页 |
| 6.2 展望 | 第99-101页 |
| 参考文献 | 第101-110页 |
| 攻读学位期间研究成果 | 第110-112页 |
| 致谢 | 第112页 |
