| 中文摘要 | 第13-17页 |
| Abstract | 第17-21页 |
| 1 前言 | 第22-38页 |
| 1.1 水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的研究概况 | 第22-29页 |
| 1.1.1 水稻条纹叶枯病分布、危害及防治 | 第22-23页 |
| 1.1.2 RSV的分类地位及病毒粒体形态 | 第23页 |
| 1.1.3 RSV寄主范围及传播特性 | 第23-24页 |
| 1.1.4 RSV致病性分化及品种抗性 | 第24-25页 |
| 1.1.5 RSV的基因组结构与功能 | 第25-28页 |
| 1.1.5.1 RNA1区段 | 第25-26页 |
| 1.1.5.2 RNA2区段 | 第26-27页 |
| 1.1.5.3 RNA3区段 | 第27-28页 |
| 1.1.5.4 RNA4区段 | 第28页 |
| 1.1.6 RSV的变异 | 第28-29页 |
| 1.2 植物生长素信号传导途径的研究进展 | 第29-37页 |
| 1.2.1 生长素在植物生长发育过程中的作用 | 第29页 |
| 1.2.2 植物内源生长素的合成 | 第29-30页 |
| 1.2.3 植物内源IAA的分布与运输 | 第30-31页 |
| 1.2.4 生长素信号传导途径 | 第31-36页 |
| 1.2.4.1 生长素早期反应基因家族 | 第31-33页 |
| 1.2.4.2 生长素反应因子(auxinresponsivefactors,ARFs) | 第33-34页 |
| 1.2.4.3 植物生长素受体蛋白的确定 | 第34页 |
| 1.2.4.4 SCF~(TIR1)蛋白复合体介导生长素信号传导 | 第34-36页 |
| 1.2.5 植物病原物与寄住互作中的生长素信号传导 | 第36-37页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第37-38页 |
| 2 Real-time RT-PCR在RSV定量检测中的建立和优化 | 第38-57页 |
| 2.1 材料与方法 | 第38-41页 |
| 2.1.1 材料 | 第38页 |
| 2.1.1.1 植物材料和病毒毒源 | 第38页 |
| 2.1.1.2 主要试剂和仪器 | 第38页 |
| 2.1.2 RSV编码的7个基因在水稻悬浮细胞内的表达变化分析 | 第38-40页 |
| 2.1.2.1 水稻悬浮细胞培养与RSV侵染 | 第38-39页 |
| 2.1.2.2 引物设计 | 第39页 |
| 2.1.2.3 总RNA提取 | 第39-40页 |
| 2.1.2.4 Real-time RT-PCR检测 | 第40页 |
| 2.1.2.5 数据分析 | 第40页 |
| 2.1.3 不同传毒效率灰飞虱单头虫体内RSV编码基因的表达差异分析 | 第40-41页 |
| 2.1.3.1 不同传毒能力灰飞虱种群的筛选和培育 | 第40页 |
| 2.1.3.2 单头灰飞虱传毒能力的检测 | 第40页 |
| 2.1.3.3 单头灰飞虱总RNA提取 | 第40-41页 |
| 2.1.3.4 Real-time RT-PCR分析 | 第41页 |
| 2.1.3.5 数据分析 | 第41页 |
| 2.1.4 RSV在武育粳3号和KT95-418两种水稻悬浮细胞内复制变化 | 第41页 |
| 2.1.4.1 病毒生物学测定 | 第41页 |
| 2.1.4.2 水稻悬浮细胞培养与RSV侵染 | 第41页 |
| 2.1.4.3 总RNA提取 | 第41页 |
| 2.1.4.4 Real-time RT-PCR分析 | 第41页 |
| 2.1.4.5 数据分析 | 第41页 |
| 2.2 结果分析 | 第41-52页 |
| 2.2.1 RSV7个基因的扩增及其引物特异性的分析 | 第41页 |
| 2.2.2 RSV基因在水稻悬浮细胞内的RNA表达量的变化 | 第41-42页 |
| 2.2.3 RSV基因在水稻悬浮细胞内的RNA表达量变化显著性分析 | 第42页 |
| 2.2.4 RSV基因在不同传毒效率灰飞虱体内表达轮廓分析 | 第42页 |
| 2.2.5 武育粳3号和KT95-418的病毒生物学特征 | 第42-52页 |
| 2.2.6 武育粳3号和KT95-418悬浮细胞内CP基因表达差异的分析 | 第52页 |
| 2.3 讨论 | 第52-57页 |
| 2.3.1 Real-time RT-PCR对RSV病毒检测标准体系的建立 | 第52-53页 |
| 2.3.2 RSV RdRp基因对RSV的复制可能起关键作用 | 第53页 |
| 2.3.3 RSV CP基因可以作为检测RSV的分子标记 | 第53-54页 |
| 2.3.4 NSvc2、NSvc4和SP基因可能参与了病毒的胞间运动和介体传毒 | 第54-55页 |
| 2.3.5 NS3基因可能为RSV的基因沉默抑制子 | 第55页 |
| 2.3.6 real-time RT-PCR技术可以作为传统品种抗病性鉴定的验证手段 | 第55-57页 |
| 3 RSV侵染水稻过程中生长素信号传导途径相关基因的验证 | 第57-76页 |
| 3.1 材料与方法 | 第57-59页 |
| 3.1.1 材料 | 第57页 |
| 3.1.1.1 植物材料和病毒毒源 | 第57页 |
| 3.1.1.2 主要试剂与仪器 | 第57页 |
| 3.1.2 方法 | 第57-59页 |
| 3.1.2.1 水稻种子处理与育苗 | 第57-58页 |
| 3.1.2.2 RSV病毒接种 | 第58页 |
| 3.1.2.3 总RNA提取 | 第58页 |
| 3.1.2.4 引物设计与合成 | 第58-59页 |
| 3.1.2.5 Real-time RT-PCR检测 | 第59页 |
| 3.1.2.6 数据分析 | 第59页 |
| 3.2 结果分析 | 第59-72页 |
| 3.2.1 生长素信号传导中相关基因的引物特异性分析 | 第59-63页 |
| 3.2.2 生长素信号传导中相关基因的标准曲线的建立 | 第63-65页 |
| 3.2.3 RSV侵染水稻悬浮细胞过程中生长素信号传导中相关基因的表达变化 | 第65-68页 |
| 3.2.4 RSV侵染水稻植株发病过程中生长素部分早期应答基因的表达变化 | 第68-72页 |
| 3.3 讨论 | 第72-76页 |
| 3.3.1 基因芯片的分析结果只反映了RSV侵染水稻发病后时期相关基因转录水平的变化 | 第72页 |
| 3.3.2 RSV侵染能够显著引起这些生长素信号传导途径早期应答基因mRNA的上调 | 第72-73页 |
| 3.3.3 病毒侵染与不同生理条件下的比较 | 第73-74页 |
| 3.3.4 抗病水稻与感病水稻在生长素早期反应基因表达上的比较 | 第74-76页 |
| 4 RSV侵染对水稻内源生长素合成的影响和外源生长素对RSV复制的影响 | 第76-84页 |
| 4.1 材料与方法: | 第76-77页 |
| 4.1.1 材料 | 第76页 |
| 4.1.1.1 植物材料和病毒毒源 | 第76页 |
| 4.1.1.2 试剂与仪器 | 第76页 |
| 4.1.2 方法 | 第76-77页 |
| 4.1.2.1 病毒接种与样品处理 | 第76-77页 |
| 4.1.2.2 水稻悬浮细胞培养与RSV侵染 | 第77页 |
| 4.1.2.3 引物设计 | 第77页 |
| 4.1.2.4 总RNA提取 | 第77页 |
| 4.1.2.5 real-time RT-PCR检测 | 第77页 |
| 4.1.2.6 数据分析 | 第77页 |
| 4.1.2.7 内源生长素的HPLC测定 | 第77页 |
| 4.2 结果分析 | 第77-81页 |
| 4.2.1 生长素合成酶基因YUCAA1引物特异性验证与real-time RT-PCR精确性检验 | 第77-78页 |
| 4.2.2 RSV侵染对生长素合成酶基因表达的影响 | 第78-79页 |
| 4.2.3 RSV侵染对水稻内源生长素的影响 | 第79页 |
| 4.2.4 不同处理植株中RSV复制变化 | 第79-81页 |
| 4.3 讨论 | 第81-84页 |
| 4.3.1 生长素信号传导参与了病原物与寄主互作过程 | 第81页 |
| 4.3.2 RSV侵染能够引起水稻内源生长素含量的增加 | 第81-82页 |
| 4.3.3 外施生长素可抑制RSV在植株内的复制 | 第82-84页 |
| 5 水稻生长素受体基因在RSV侵染后的差异表达 | 第84-93页 |
| 5.1 材料与方法 | 第84-86页 |
| 5.1.1 材料 | 第84页 |
| 5.1.1.1 植物材料和病毒毒源 | 第84页 |
| 5.1.1.2 试剂与仪器 | 第84页 |
| 5.1.2 方法 | 第84-86页 |
| 5.1.2.1 水稻生长素受体蛋白的推测 | 第84-85页 |
| 5.1.2.2 序列分析 | 第85页 |
| 5.1.2.3 系统进化分析 | 第85页 |
| 5.1.2.4 病毒接种 | 第85页 |
| 5.1.2.5 引物设计 | 第85页 |
| 5.1.2.6 总RNA提取 | 第85-86页 |
| 5.1.2.7 real-time RT-PCR检测 | 第86页 |
| 5.1.2.8 数据分析 | 第86页 |
| 5.2 结果分析 | 第86-91页 |
| 5.2.1 水稻生长素受体基因的推测 | 第86页 |
| 5.2.2 基因组结构与染色体定位 | 第86页 |
| 5.2.3 序列与系统进化分析 | 第86-89页 |
| 5.2.4 水稻生长素受体基因的引物特异性分析与精确性验证 | 第89-90页 |
| 5.2.5 RSV和RDV侵染后水稻生长素受体基因的差异表达 | 第90-91页 |
| 5.3 讨论 | 第91-93页 |
| 6 RSV与水稻互作中生长素信号传导相关基因的克隆与表达 | 第93-114页 |
| 6.1 研究材料 | 第93-94页 |
| 6.1.1 植物材料、菌种与载体 | 第93-94页 |
| 6.1.2 主要试剂与仪器 | 第94页 |
| 6.1.3 供试植物处理 | 第94页 |
| 6.2 研究方法 | 第94-103页 |
| 6.2.1 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因的克隆 | 第94-97页 |
| 6.2.1.1 引物设计 | 第94-95页 |
| 6.2.1.2 总RNA提取 | 第95页 |
| 6.2.1.3 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第95页 |
| 6.2.1.4 DNA片段的切胶纯化 | 第95页 |
| 6.2.1.5 PCR扩增产物和pMD18-T克隆载体的连接 | 第95-96页 |
| 6.2.1.6 感受态细胞的制备 | 第96页 |
| 6.2.1.7 连接反应物对宿主感受态细胞的转化 | 第96页 |
| 6.2.1.8 碱裂解法小量提取质粒 | 第96-97页 |
| 6.2.1.9 重组克隆的PCR筛选 | 第97页 |
| 6.2.1.10 重组克隆的酶切鉴定 | 第97页 |
| 6.2.1.11 序列测定与分析 | 第97页 |
| 6.2.2 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白的原核表达 | 第97-102页 |
| 6.2.2.1 目的片段与pGEX-4T-3载体的酶切回收 | 第97-98页 |
| 6.2.2.2 目的片段与pGEX-4T-3载体连接转化 | 第98页 |
| 6.2.2.3 重组质粒的提取与鉴定 | 第98页 |
| 6.2.2.4 将测序正确的重组质粒转化BE21细胞 | 第98-99页 |
| 6.2.3.5 融合蛋白的诱导表达 | 第99页 |
| 6.2.3.6 蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第99页 |
| 6.2.3.7 重组蛋白包涵体的纯化和复性 | 第99-100页 |
| 6.2.3.8 融合蛋白的抗血清制备 | 第100页 |
| 6.2.3.9 采用间接ELISA法测定抗血清效价 | 第100页 |
| 6.2.3.10 Western blot鉴定 | 第100-101页 |
| 6.2.3.11 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因上游序列和下游序列调控元件分析 | 第101页 |
| 6.2.3.12 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白的生物信息学 | 第101-102页 |
| 6.2.4 生物胁迫和非生物胁迫对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响 | 第102-103页 |
| 6.2.4.1 RSV侵染对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响 | 第102页 |
| 6.2.4.2 外源生长素处理对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53 mRNA转录和蛋白表达的影响 | 第102页 |
| 6.2.4.3 MG132处理对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响 | 第102-103页 |
| 6.3 结果分析 | 第103-111页 |
| 6.3.1 SAuRs基因的RT-PCR扩增结果 | 第103页 |
| 6.3.2 SAuRs基因的克隆重组质粒酶切鉴定 | 第103-104页 |
| 6.3.3 水稻SAuRs基因的序列分析 | 第104页 |
| 6.3.4 水稻3个SAuRs基因的原核表达载体的酶切鉴定 | 第104-105页 |
| 6.3.5 水稻3个OsSAuRs蛋白的诱导表达 | 第105页 |
| 6.3.6 OsSAuRs蛋白的抗血清制备及效价测定 | 第105-107页 |
| 6.3.7 水稻OsSAuRs蛋白抗血清特异性的鉴定 | 第107-108页 |
| 6.3.8 OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53的生物信息学分析 | 第108-109页 |
| 6.3.9 RSV侵染对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响 | 第109页 |
| 6.3.10 生长素处理对水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白表达的影响 | 第109-111页 |
| 6.3.11 MG132处理对OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53融合蛋白降解的影响 | 第111页 |
| 6.4 讨论 | 第111-114页 |
| 6.4.1 外源生长素处理水稻幼苗可显著提高OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因的mRNA含量 | 第111-112页 |
| 6.4.2 OsSAuR39和OsSAuR53基因是水稻OsSAuRs基因家族成员 | 第112-113页 |
| 6.4.3 OsSAuR53蛋白在RSV病株中高效表达 | 第113-114页 |
| 7 水稻3个OsSAuRs蛋白的亚细胞定位及功能验证 | 第114-136页 |
| 7.1 研究材料 | 第114-115页 |
| 7.1.1 植物材料、菌种与载体 | 第114页 |
| 7.1.2 主要试剂与仪器 | 第114-115页 |
| 7.2 方法 | 第115-121页 |
| 7.2.1 引物设计与合成 | 第115页 |
| 7.2.2 用于亚细胞定位的重组表达载体构建与细胞转化 | 第115-117页 |
| 7.2.2.1 用于亚细胞定位的目的基因片段克隆 | 第115-116页 |
| 7.2.2.2 pEGAD、pMD-S1、pMD-S39和pMD-S53质粒的酶切和连接 | 第116页 |
| 7.2.2.3 用于亚细胞定位的重组表达质粒的鉴定 | 第116页 |
| 7.2.2.4 待转化洋葱表皮的制备 | 第116页 |
| 7.2.2.5 重组质粒转化洋葱表皮细胞 | 第116页 |
| 7.2.2.6 亚细胞定位检测 | 第116页 |
| 7.2.2.7 农杆菌EH105感受提细胞制备 | 第116页 |
| 7.2.2.8 pEGAD-OsSAuR1、pEGAD-OsSAuR39和pEGAD-OsSAuR53转化农杆菌EH105 | 第116-117页 |
| 7.2.2.9 重组根癌农杆菌EHA105的菌落PCR验证 | 第117页 |
| 7.2.3 用于过量表达的重组表达载体构建及转化 | 第117-118页 |
| 7.2.3.1 用于过量表达的目的基因片段克隆 | 第117页 |
| 7.2.3.2 pKYLX71:35S2、pMD-S1、pMD-S39和pMD-S53质粒的酶切和连接 | 第117页 |
| 7.2.3.3 用于亚细胞定位的重组表达质粒的鉴定 | 第117页 |
| 7.2.3.4 pKYLX71-OsSAuR1、pKYLX71-OsSAuR39和pKYLX71-OsSAuR53转化农杆菌EH105 | 第117页 |
| 7.2.3.5 重组根癌农杆菌EHA105的菌落PCR验证 | 第117-118页 |
| 7.2.4 重组根癌农杆菌EHA105转化A.thaliana | 第118-119页 |
| 7.2.4.1 拟南芥植株的培养 | 第118页 |
| 7.2.4.2 拟南芥浸花法转化 | 第118页 |
| 7.2.4.3 转基因拟南芥的抗性筛选 | 第118页 |
| 7.2.4.4 抗性拟南芥DNA提取 | 第118-119页 |
| 7.2.4.5 抗性拟南芥PCR鉴定 | 第119页 |
| 7.2.4.6 抗性拟南芥GUS染色 | 第119页 |
| 7.2.5 重组根癌农杆菌EHA105叶盘侵染法转化烟草 | 第119-121页 |
| 7.2.5.1 受体材料的准备 | 第119页 |
| 7.2.5.2 农杆菌培养 | 第119页 |
| 7.2.5.3 浸染 | 第119页 |
| 7.2.5.4 选择培养 | 第119-120页 |
| 7.2.5.5 继代选择培养 | 第120页 |
| 7.2.5.6 生根培养 | 第120页 |
| 7.2.5.7 转基因烟草的DNA提取 | 第120页 |
| 7.2.5.8 转基因烟草的PCR鉴定 | 第120页 |
| 7.2.5.9 转基因烟草GUS染色 | 第120页 |
| 7.2.5.10 转基因烟草TMV接种试验 | 第120-121页 |
| 7.3 结果分析 | 第121-132页 |
| 7.3.1 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53蛋白的亚细胞定位 | 第121-124页 |
| 7.3.1.1 OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53用于亚细胞定位的植物表达载体的构建 | 第121-122页 |
| 7.3.1.2 用于亚细胞定位的重组植物表达载体转化农杆菌 | 第122-123页 |
| 7.3.1.3 OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53 EGFP融合蛋白的亚细胞定位 | 第123-124页 |
| 7.3.2 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53的功能验证 | 第124-132页 |
| 7.3.2.1 pKYLX-OsSAuR1、pKYLX-OsSAuR39和pKYLX-OsSAuR53植物表达载体的构建 | 第124-125页 |
| 7.3.2.2 pKYLX-OsSAuR1、pKYLX-OsSAuR39和pKYLX-OsSAuR53质粒转化农杆菌分析 | 第125-126页 |
| 7.3.2.3 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53转基因烟草抗性筛选与验证 | 第126-128页 |
| 7.3.2.4 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53转基因烟草表型分析 | 第128-129页 |
| 7.3.2.5 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因在烟草中过量表达对TMV复制增值的影响 | 第129-131页 |
| 7.3.2.6 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53转基因拟南芥抗性筛选与验证及表型分析 | 第131-132页 |
| 7.4 讨论 | 第132-136页 |
| 7.4.1 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53均为核定位蛋白 | 第132-133页 |
| 7.4.2 OsSAuR1和OsSAuR39在拟南芥的生长和发育中具有功能冗余性 | 第133页 |
| 7.4.3 OsSAuR53在植物的生长和发育中具有一定特殊的功能 | 第133-134页 |
| 7.4.4 水稻OsSAuR1、OsSAuR39和OsSAuR53基因在烟草中过量表达对TMV复制增值没有影响 | 第134-136页 |
| 8 结论与展望 | 第136-141页 |
| 参考文献 | 第141-159页 |
| 致谢 | 第159页 |
