| 内容提要 | 第4-5页 |
| 中文摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第1章 绪论 | 第14-41页 |
| 1.1 烟草尼古丁去甲基酶及反应机制研究综述 | 第14-24页 |
| 1.1.1 尼古丁去甲基化研究的历史 | 第15-16页 |
| 1.1.2 甲基转移假说和氧化去甲基化假说 | 第16-18页 |
| 1.1.3 酶促氧化去甲基化 | 第18-20页 |
| 1.1.4 影响烟草尼古丁去甲基化的因素 | 第20-23页 |
| 1.1.5 展望 | 第23-24页 |
| 1.2 RACE技术的原理 | 第24-31页 |
| 1.2.1 RACE技术在全长cDNA克隆中的应用 | 第24-28页 |
| 1.2.2 RACE技术的优点和缺点 | 第28-29页 |
| 1.2.3 RACE技术中的常见问题及对策 | 第29-30页 |
| 1.2.4 RACE技术的其他应用及其前景 | 第30-31页 |
| 1.3 分子模拟相关软件介绍 | 第31-40页 |
| 1.3.1 InsightⅡ软件介绍 | 第31-35页 |
| 1.3.2 分子对接软件AUTODOCK介绍 | 第35-40页 |
| 1.4 本论文的研究意义与主要内容 | 第40-41页 |
| 第2章 蓝茉莉叶烟草尼古丁去甲基酶基因同源克隆 | 第41-64页 |
| 2.1 引言 | 第41页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第41-45页 |
| 2.2.1 材料 | 第41-42页 |
| 2.2.2 仪器 | 第42页 |
| 2.2.3 实验试剂与溶液的配制 | 第42-45页 |
| 2.3 实验方法 | 第45-53页 |
| 2.3.1 烟草叶片乙烯利预处理 | 第45页 |
| 2.3.2 烟草叶片总RNA提取 | 第45-46页 |
| 2.3.3 RNA的甲醛变性电泳 | 第46-47页 |
| 2.3.4 单链cDNA合成(3'-RACE-Ready cDNA) | 第47页 |
| 2.3.5 烟草尼古丁去甲基酶基因3’RACE | 第47-48页 |
| 2.3.6 烟草尼古丁去甲基酶基因5’RACE | 第48-49页 |
| 2.3.7 目的基因片断回收 | 第49-50页 |
| 2.3.8 目的DNA片段与载体DNA片段的连接 | 第50页 |
| 2.3.9 OMEGA PCR产物纯化试剂盒纯化连接产物 | 第50-51页 |
| 2.3.10 电转化感受态细胞的制备 | 第51页 |
| 2.3.11 电转化重组质粒 | 第51-52页 |
| 2.3.12 重组质粒的提取 | 第52页 |
| 2.3.13 重组质粒的筛选 | 第52-53页 |
| 2.3.14 阳性重组质粒的测序 | 第53页 |
| 2.3.15 烟草尼古丁去甲基酶基因的序列比对分析 | 第53页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第53-63页 |
| 2.4.1 总RNA提取 | 第53-54页 |
| 2.4.2 尼古丁去甲基酶cDNA的3'RACE | 第54-57页 |
| 2.4.3 尼古丁去甲基酶cDNA的5'RACE | 第57-60页 |
| 2.4.4 尼古丁去甲基酶全长cDNA获得 | 第60-63页 |
| 2.5 小结 | 第63-64页 |
| 第3章 蓝茉莉叶烟草尼古丁去甲基酶基因的生物信息学分析 | 第64-74页 |
| 3.1 引言 | 第64页 |
| 3.2 材料与方法 | 第64-65页 |
| 3.2.1 生物信息学工具 | 第64-65页 |
| 3.2.2 网络资源 | 第65页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第65-72页 |
| 3.3.1 蛋白序列motif搜索 | 第65-66页 |
| 3.3.2 蛋白序列一级结构分析 | 第66-70页 |
| 3.3.3 蛋白序列二级结构预测 | 第70页 |
| 3.3.4 保守位点综合分析 | 第70-71页 |
| 3.3.5 序列同源性分析及进化关系 | 第71-72页 |
| 3.4 小结 | 第72-74页 |
| 第4章 蓝茉莉叶烟草尼古丁去甲基酶酵母异源表达 | 第74-81页 |
| 4.1 引言 | 第74页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第74-75页 |
| 4.3 实验方法 | 第75-77页 |
| 4.3.1 尼古丁去甲基酶蛋白编码序列扩增 | 第75页 |
| 4.3.2 表达载体构建 | 第75页 |
| 4.3.3 酿酒酵母感受态细胞的制备 | 第75页 |
| 4.3.4 酿酒酵母转化 | 第75-76页 |
| 4.3.5 目的蛋白诱导表达 | 第76页 |
| 4.3.6 分离制备微体组分 | 第76页 |
| 4.3.7 鉴定目的蛋白正确折叠 | 第76-77页 |
| 4.3.8 微体P450蛋白含量的测定 | 第77页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第77-80页 |
| 4.4.1 尼古丁去甲基酶蛋白编码序列扩增 | 第77-78页 |
| 4.4.2 鉴定目的蛋白正确折叠 | 第78-79页 |
| 4.4.4 微体P450蛋白含量的测定 | 第79-80页 |
| 4.5 小结 | 第80-81页 |
| 第5章 尼古丁去甲基酶酶学性质表征 | 第81-91页 |
| 5.1 引言 | 第81页 |
| 5.2 实验仪器与试剂 | 第81-82页 |
| 5.2.1 仪器 | 第81页 |
| 5.2.2 试剂 | 第81-82页 |
| 5.3 实验方法 | 第82-84页 |
| 5.3.1 尼古丁去甲基化酶活性测定 | 第82页 |
| 5.3.2 高效液相色谱-质谱条件 | 第82页 |
| 5.3.3 温度对酶的影响 | 第82-83页 |
| 5.3.4 pH对酶的影响 | 第83页 |
| 5.3.5 动力学常数测定 | 第83页 |
| 5.3.6 辅助因子对酶的影响 | 第83页 |
| 5.3.7 细胞色素p450抑制剂对酶活性的影响 | 第83-84页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第84-90页 |
| 5.4.1 尼古丁去甲基化酶活性测定 | 第84-86页 |
| 5.4.2 温度对酶的影响 | 第86页 |
| 5.4.3 pH对酶的影响 | 第86-87页 |
| 5.4.4 动力学常数测定 | 第87-88页 |
| 5.4.5 辅助因子对酶的影响 | 第88-89页 |
| 5.4.6 细胞色素p450抑制剂对酶活性的影响 | 第89-90页 |
| 5.5 小结 | 第90-91页 |
| 第6章 尼古丁去甲基化酶与抑制剂的分子对接研究 | 第91-109页 |
| 6.1 引言 | 第91-92页 |
| 6.2 材料和方法 | 第92-94页 |
| 6.2.1 尼古丁去甲基酶与CYP 1B1的序列比对 | 第92页 |
| 6.2.2 尼古丁去甲基酶的同源模建 | 第92-93页 |
| 6.2.3 尼古丁去甲基酶与底物及抑制剂的分子对接 | 第93页 |
| 6.2.4 尼古丁去甲基酶抑制剂定量构效关系模型构建 | 第93-94页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第94-107页 |
| 6.3.1 尼古丁去甲基酶与CYP 1B1的序列比对 | 第94-95页 |
| 6.3.2 尼古丁去甲基酶的同源模建 | 第95-97页 |
| 6.3.3 尼古丁去甲基酶模建结构的评估 | 第97-98页 |
| 6.3.4 尼古丁去甲基酶与底物以及抑制剂结合的自由能计算 | 第98-103页 |
| 6.3.5 烟草尼古丁去甲基酶抑制剂定量构效关系(QSAR)模型建立 | 第103-107页 |
| 6.4 小结 | 第107-109页 |
| 第7章 结论 | 第109-110页 |
| 参考文献 | 第110-117页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118页 |
