| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 第一篇 文献综述 | 第16-46页 |
| 第一章 猪链球菌2型毒力因子及研究方法进展 | 第16-46页 |
| 1 猪链球菌毒力因子研究进展 | 第17-25页 |
| 1.1 荚膜多糖 | 第17-19页 |
| 1.2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子 | 第19-21页 |
| 1.3 溶血素 | 第21-22页 |
| 1.4 黏附相关的毒力因子 | 第22-24页 |
| 1.5 与血液中的存活和传播有关的毒力因子 | 第24-25页 |
| 2 组学方法在猪链球菌研究中的应用 | 第25-32页 |
| 2.1 基因组学 | 第25-27页 |
| 2.2 蛋白质组学 | 第27-29页 |
| 2.3 转录组学 | 第29页 |
| 2.4 翻译后修饰组学 | 第29-32页 |
| 参考文献 | 第32-46页 |
| 第二篇 试验研究 | 第46-168页 |
| 第二章 猪链球菌2型天然强弱毒株的比较基因组学和比较蛋白组学分析 | 第46-76页 |
| 1 材料与方法 | 第48-60页 |
| 1.1 菌株及培养方法 | 第48页 |
| 1.2 基因组序列分析 | 第48-50页 |
| 1.3 比较蛋白组学分析 | 第50-51页 |
| 1.4 信号肽、跨膜区和(I/L)(P/A)XTG基序分析 | 第51-52页 |
| 1.5 比较基因组学和比较蛋白组学综合分析 | 第52页 |
| 1.6 western blot验证 | 第52-53页 |
| 1.7 分选酶系统相关基因的敲除 | 第53-59页 |
| 1.8 缺失株和野生株半数致死量的测定 | 第59页 |
| 1.9 western blot验证Sortase C与其对应底物的互作 | 第59-60页 |
| 2 结果 | 第60-70页 |
| 2.1 基因组的装配和补洞 | 第60页 |
| 2.2 基因组注释 | 第60页 |
| 2.3 比较基因组学分析 | 第60-63页 |
| 2.4 比较蛋白组学分析 | 第63-66页 |
| 2.5 强毒特有基因在其余链球菌中的分布情况 | 第66-68页 |
| 2.6 分选酶系统相关基因的敲除 | 第68-69页 |
| 2.7 缺失株和野生株半数致死量的测定 | 第69页 |
| 2.8 Far-Western blot验证Sortase C及其对应底物的关系 | 第69-70页 |
| 3 讨论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 第三章 基于相同亲本株的猪链球菌2型毒力增强及致弱突变株的比较蛋白组学分析 | 第76-110页 |
| 1 材料与方法 | 第77-87页 |
| 1.1 菌株及培养方法 | 第77-81页 |
| 1.2 pepT缺失株的构建 | 第81页 |
| 1.3 亲本株及缺失株生长曲线的测定 | 第81-82页 |
| 1.4 亲本株及缺失株LD_(50)的测定 | 第82页 |
| 1.5 胞外蛋白的提取 | 第82页 |
| 1.6 基于2D-DIGE的比较蛋白组学分析 | 第82-83页 |
| 1.7 基于label-free的比较蛋白组学分析 | 第83-84页 |
| 1.8 差异蛋白的转录水平分析 | 第84-85页 |
| 1.9 差异蛋白的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备 | 第85页 |
| 1.10 差异蛋白的western blot验证 | 第85页 |
| 1.11 差异蛋白的生物信息学分析 | 第85-86页 |
| 1.12 SBP2的功能验证 | 第86-87页 |
| 2 结果 | 第87-103页 |
| 2.1 pepT缺失株的构建及rfeA缺失株稳定性检测 | 第87-89页 |
| 2.2 亲本株及缺失株生长曲线没有显著差异 | 第89页 |
| 2.3 亲本株及缺失株LD_(50)的比较分析 | 第89-90页 |
| 2.4 2D-DIGE鉴定到的差异蛋白汇总 | 第90-91页 |
| 2.5 label-free proteomics方法鉴定到的差异蛋白汇总 | 第91-92页 |
| 2.6 多种方法获得的缺失株差异蛋白结果汇总 | 第92-93页 |
| 2.7 qRT-PCR结果分析 | 第93-94页 |
| 2.8 Western blot结果分析 | 第94页 |
| 2.9 GO功能分类分析发现发挥催化、代谢及结合活性差异蛋白的重要性 | 第94-99页 |
| 2.10 毒力因子互作网络证明新鉴定的差异蛋白在已知的毒力因子系统中的重要作用 | 第99-100页 |
| 2.11 Venn分析提示最有价值的毒力相关因子SBP2 | 第100页 |
| 2.12 间接免疫荧光分析发现SBP2可以黏附到HEp-2细胞 | 第100-101页 |
| 2.13 蛋白黏附抑制再次验证SBP2对HEp-2细胞黏附的贡献 | 第101-102页 |
| 2.14 Far-Western blot验证SBP2是一个重要的细胞外基质蛋白结合蛋白 | 第102-103页 |
| 3 讨论 | 第103-106页 |
| 参考文献 | 第106-110页 |
| 第四章 猪链球菌2型菌株适应体内环境及发挥毒力作用的机制 | 第110-144页 |
| 1 材料与方法 | 第111-120页 |
| 1.1 菌株 | 第111页 |
| 1.2 完全体外培养的细菌的培养条件及细菌的收集 | 第111页 |
| 1.3 体外模拟细菌体内厌氧条件的培养方式及菌体的收集 | 第111页 |
| 1.4 体内培养方式及细菌的分离 | 第111-112页 |
| 1.5 iTRAQ比较蛋白组分析体内外不同培养方式的细菌的蛋白表达量变化 | 第112-114页 |
| 1.6 蛋白注释 | 第114页 |
| 1.7 qRT-PCR分析差异蛋白的转录水平 | 第114页 |
| 1.8 差异蛋白MRP, fabG和adhE原核表达和纯化及多克隆抗体的制备 | 第114-115页 |
| 1.9 差异蛋白的western blot验证 | 第115页 |
| 1.10 差异蛋白的生物信息学分析 | 第115-118页 |
| 1.11 Western blot验证adhE在厌氧培养条件下表达量的变化 | 第118-119页 |
| 1.12 间接免疫荧光实验探究adhE蛋白对HEp-2和Caco-2细胞的黏附 | 第119页 |
| 1.13 同源重组方法构建adhE缺失株 | 第119页 |
| 1.14 测定缺失株黏附水平的变化 | 第119-120页 |
| 1.15 Far-western blot分析adhE与Hsp60的互作关系 | 第120页 |
| 1.16 测定anti-fabG抗体封闭后SS2在猪血中存活能力的变化 | 第120页 |
| 2 结果 | 第120-138页 |
| 2.1 革兰氏染色观察体内外培养的细菌 | 第120-121页 |
| 2.2 质谱(MS)数据的质控 | 第121-122页 |
| 2.3 蛋白圈图展示表达量变化的总图谱 | 第122-123页 |
| 2.4 差异蛋白的操纵子分析 | 第123-124页 |
| 2.5 差异蛋白的qRT-PCR结果分析 | 第124-125页 |
| 2.6 Western blot结果分析 | 第125页 |
| 2.7 噬菌体和基因岛对SS2适应宿主环境的作用 | 第125-126页 |
| 2.8 GO功能分类 | 第126-127页 |
| 2.9 差异蛋白的功能富集分析 | 第127-131页 |
| 2.10 基于富集分析的cluster分析 | 第131-132页 |
| 2.11 蛋白互作网络分析 | 第132-133页 |
| 2.12 WB分析厌氧培养条件下adhE表达量的变化 | 第133-134页 |
| 2.13 adhE基因缺失株的构建 | 第134页 |
| 2.14 重组adhE蛋白(radhE)对HEp-2和Caco-2细胞的黏附 | 第134-135页 |
| 2.15 △adhE对Caco-2细胞的黏附水平的变化 | 第135-136页 |
| 2.16 western blot分析radhE与Hsp60的互作 | 第136页 |
| 2.17 anti-fabG抗体封闭的SS2在猪血中存活能力的变化 | 第136-138页 |
| 3 讨论 | 第138-140页 |
| 参考文献 | 第140-144页 |
| 第五章 猪链球菌蛋白的琥珀酰化及乙酰化修饰 | 第144-168页 |
| 1 材料和方法 | 第145-151页 |
| 1.1 材料和试剂 | 第145-146页 |
| 1.2 菌株及培养方法 | 第146-147页 |
| 1.3 蛋白样品的提取 | 第147页 |
| 1.4 胰酶消化蛋白样品 | 第147页 |
| 1.5 高效液相色谱分离 | 第147页 |
| 1.6 亲和富集 | 第147页 |
| 1.7 蛋白LC-MS/MS分析 | 第147-148页 |
| 1.8 数据库检索 | 第148页 |
| 1.9 MS数据的QC验证 | 第148页 |
| 1.10 蛋白注释方法(基因本体论GO注释、结构域Domain注释、KEGG通路注释、亚细胞定位预测) | 第148-150页 |
| 1.11 功能富集分析(GO、Domain、KEGG) | 第150页 |
| 1.12 基序分析 | 第150-151页 |
| 2 结果 | 第151-164页 |
| 2.1 WB鉴定SS蛋白中赖氨酸琥珀酰化和乙酰化修饰结果概观 | 第151-152页 |
| 2.2 琥珀酰化蛋白鉴定的质控 | 第152页 |
| 2.3 琥珀酰化蛋白的鉴定结果 | 第152-154页 |
| 2.4 琥珀酰化蛋白的功能分类 | 第154-155页 |
| 2.5 琥珀酰化蛋白的功能富集分析 | 第155-157页 |
| 2.6 琥珀酰化位点序列识别基序 | 第157-158页 |
| 2.7 乙酰化蛋白鉴定的质控 | 第158页 |
| 2.8 乙酰化蛋白的鉴定结果 | 第158-159页 |
| 2.9 乙酰化蛋白的功能分类 | 第159-161页 |
| 2.10 乙酰化蛋白的功能富集分析 | 第161-163页 |
| 2.11 乙酰化序列识别模体 | 第163-164页 |
| 3 讨论 | 第164-165页 |
| 参考文献 | 第165-168页 |
| 攻读博士期间发表论文 | 第168-170页 |
| 致谢 | 第170页 |
