| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 英文缩略表 | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-21页 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统的研究历程 | 第13页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统的结构与分类 | 第13-14页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9的作用机理 | 第14-15页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9靶位点选择及相关工具 | 第15-16页 |
| 1.5 CRISPR/Cas9的应用 | 第16-18页 |
| 1.5.1 在基因功能研究中的应用 | 第16-17页 |
| 1.5.2 在模式生物构建中的应用 | 第17-18页 |
| 1.5.3 在新品种改造和培育中的应用 | 第18页 |
| 1.5.4 在基因治疗中的应用 | 第18页 |
| 1.6 CRISPR/Cas9与ZFN和TALEN比较 | 第18-19页 |
| 1.7 CRISPR/Cas9技术存在的问题 | 第19页 |
| 1.8 研究展望 | 第19-20页 |
| 1.9 本研究的立题依据及研究内容 | 第20-21页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9载体的构建与鉴定 | 第21-32页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 材料 | 第21-22页 |
| 2.2.1 主要试验材料 | 第21页 |
| 2.2.2 主要试验试剂 | 第21页 |
| 2.2.3 主要试验仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.2.4 主要试验试剂的配制 | 第22页 |
| 2.3 试验方法 | 第22-27页 |
| 2.3.1 MSTN靶位点设计与合成 | 第22-23页 |
| 2.3.2 退火 | 第23页 |
| 2.3.3 pX330质粒的酶切 | 第23-24页 |
| 2.3.4 DNA胶回收 | 第24页 |
| 2.3.5 载体连接 | 第24页 |
| 2.3.6 pX330-target载体转化 | 第24-25页 |
| 2.3.7 阳性菌落的挑取与培养 | 第25页 |
| 2.3.8 质粒少量提取 | 第25页 |
| 2.3.9 质粒的鉴定 | 第25-26页 |
| 2.3.10 质粒大量提取 | 第26页 |
| 2.3.11 质粒浓度的测定 | 第26-27页 |
| 2.4 试验结果与分析 | 第27-31页 |
| 2.4.1 MSTN靶位点设计与合成 | 第27-28页 |
| 2.4.2 质粒的鉴定 | 第28-29页 |
| 2.4.3 质粒浓度的测定 | 第29-31页 |
| 2.5 讨论 | 第31-32页 |
| 第三章 绵羊原代肌卫星细胞的分离、培养及鉴定 | 第32-43页 |
| 3.1 引言 | 第32页 |
| 3.2 材料 | 第32-33页 |
| 3.2.1 主要试验材料 | 第32页 |
| 3.2.2 主要试验试剂 | 第32页 |
| 3.2.3 主要试验仪器设备 | 第32-33页 |
| 3.2.4 主要试验试剂的配制 | 第33页 |
| 3.3 试验方法 | 第33-38页 |
| 3.3.1 肌卫星细胞的分离纯化 | 第33-34页 |
| 3.3.2 肌卫星细胞的传代培养 | 第34页 |
| 3.3.3 肌卫星细胞的冻存与复苏 | 第34-35页 |
| 3.3.4 肌卫星细胞生长曲线的绘制 | 第35页 |
| 3.3.5 肌卫星细胞的诱导分化与HE细胞染色 | 第35-36页 |
| 3.3.6 肌卫星细胞总RNA的提取及逆转录 | 第36-37页 |
| 3.3.7 肌卫星细胞的鉴定 | 第37-38页 |
| 3.4 试验结果与分析 | 第38-42页 |
| 3.4.1 肌卫星细胞的分离培养 | 第38页 |
| 3.4.2 肌卫星细胞生长曲线的绘制与分析 | 第38-39页 |
| 3.4.3 肌卫星细胞的肌管诱导 | 第39-40页 |
| 3.4.4 肌卫星细胞总RNA的提取 | 第40-41页 |
| 3.4.5 肌卫星细胞的鉴定 | 第41-42页 |
| 3.5 讨论 | 第42-43页 |
| 第四章 CRISPR/Cas9载体转染肌卫星细胞及序列分析 | 第43-54页 |
| 4.1 引言 | 第43页 |
| 4.2 材料 | 第43-44页 |
| 4.2.1 主要试验材料 | 第43页 |
| 4.2.2 主要试验试剂 | 第43页 |
| 4.2.3 主要试验仪器设备 | 第43-44页 |
| 4.2.4 主要试验试剂的配制 | 第44页 |
| 4.3 试验方法 | 第44-47页 |
| 4.3.1 脂质体转染条件的优化 | 第44-45页 |
| 4.3.2 绵羊肌卫星细胞转染 | 第45页 |
| 4.3.3 CRISPR/Cas9打靶载体的活性检测 | 第45-46页 |
| 4.3.4 SURVEYOR检测靶位点突变率 | 第46页 |
| 4.3.5 极限稀释法制备单细胞克隆 | 第46页 |
| 4.3.6 MSTN基因突变细胞系的筛选和类型分析 | 第46-47页 |
| 4.4 试验结果与分析 | 第47-52页 |
| 4.4.1 脂质体转染条件的优化 | 第47页 |
| 4.4.2 CRISPR/Cas9打靶载体的活性检测 | 第47-48页 |
| 4.4.3 SURVEYOR检测靶位点突变率 | 第48-49页 |
| 4.4.4 单细胞克隆的制备及MSTN基因突变细胞系的筛选 | 第49-52页 |
| 4.5 讨论 | 第52-54页 |
| 第五章 全文结论 | 第54-55页 |
| 5.1 主要结论 | 第54页 |
| 5.2 创新点 | 第54页 |
| 5.3 后期计划 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 作者简历 | 第62页 |
