| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第10-40页 |
| 1.1 链霉菌概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 链霉菌的一般特征 | 第10-11页 |
| 1.1.2 链霉菌的发育分化周期 | 第11页 |
| 1.1.3 链霉菌的次级代谢产物及其应用 | 第11-12页 |
| 1.2 链霉菌的次级代谢调控 | 第12-23页 |
| 1.2.1 抗生素生物合成基因簇 | 第12-14页 |
| 1.2.2 隐性次级代谢生物合成基因簇 | 第14-15页 |
| 1.2.3 途径特异性调控 | 第15-16页 |
| 1.2.4 多效调控 | 第16-19页 |
| 1.2.5 全局调控(含sigma因子) | 第19-23页 |
| 1.3 链霉菌调控机制研究方法 | 第23-29页 |
| 1.3.1 链霉菌次级代谢交互调控 | 第23-25页 |
| 1.3.2 研究调控的传统方法 | 第25页 |
| 1.3.3 系统组学发掘调控网络 | 第25-29页 |
| 1.4 合成生物学与链霉菌 | 第29-32页 |
| 1.4.1 合成生物学概述 | 第29-30页 |
| 1.4.2 链霉菌合成生物学调控元件 | 第30-32页 |
| 1.5 合成生物学在代谢工程中的应用 | 第32-34页 |
| 1.5.1 代谢途径的构建 | 第32-34页 |
| 1.5.2 整个基因簇的异源表达 | 第34页 |
| 1.5.3 代谢途径中多基因的调控表达 | 第34页 |
| 1.6 提高次级代谢物产量的方法 | 第34-40页 |
| 1.6.1 改变前体供应 | 第34-35页 |
| 1.6.2 关键基因的改变 | 第35-36页 |
| 1.6.3 途径特异性调控子的调节 | 第36-37页 |
| 1.6.4 引入抗生素抗性提高代谢物产量 | 第37-38页 |
| 1.6.5 全基因组改组 | 第38页 |
| 1.6.6 基因簇定向改造提高次级代谢产物产量 | 第38-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-61页 |
| 2.1 试验材料 | 第40-51页 |
| 2.1.1 质粒、菌株和引物 | 第40-48页 |
| 2.1.2 培养基,缓冲液及抗生素 | 第48-51页 |
| 2.2 方法 | 第51-61页 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第51-52页 |
| 2.2.2 碱裂解法提取大肠杆菌质粒 | 第52-53页 |
| 2.2.3 质粒的构建 | 第53-54页 |
| 2.2.4 重组子的鉴定 | 第54页 |
| 2.2.5 细菌双杂交系统假阳性评价方法 | 第54页 |
| 2.2.6 细菌双杂交系统酶活检测方法 | 第54页 |
| 2.2.7 细菌双杂交系统的改进策略 | 第54页 |
| 2.2.8 改进的细菌双杂交系统的验证方法 | 第54-55页 |
| 2.2.9 基因芯片试验 | 第55页 |
| 2.2.10 转录组数据分析 | 第55页 |
| 2.2.11 链霉菌-大肠杆菌间的接合转移 | 第55页 |
| 2.2.12 质粒的构建 | 第55-56页 |
| 2.2.13 培养条件 | 第56页 |
| 2.2.14 二苯胺法测生物量 | 第56-57页 |
| 2.2.15 GFP荧光强度的检测 | 第57页 |
| 2.2.16 总RNA的提取 | 第57页 |
| 2.2.17 高通量测序(RNA-Seq) | 第57页 |
| 2.2.18 基于RNA-seq的操纵子分析 | 第57-58页 |
| 2.2.19 实时荧光定量PCR分析gfp的转录水平 | 第58页 |
| 2.2.20 杰多霉素B发酵液样品预处理 | 第58页 |
| 2.2.21 高效液相色谱检测杰多霉素B的浓度 | 第58页 |
| 2.2.22 链霉菌湿重的检测 | 第58页 |
| 2.2.23 天蓝色链霉菌原生质体的制备 | 第58-59页 |
| 2.2.24 碘化丙啶染色 | 第59页 |
| 2.2.25 流式细胞仪表征单个细胞荧光值 | 第59页 |
| 2.2.26 由基因芯片得ActⅡ-orf4基因和生理基因的时序性 | 第59页 |
| 2.2.27 Act的制备与检测 | 第59-60页 |
| 2.2.28 RNA-seq分析启动子活性 | 第60-61页 |
| 3 结果与讨论 | 第61-93页 |
| 3.1 细菌双杂交系统的灵敏度分析 | 第61-62页 |
| 3.2 LacZ酶活分析 | 第62-63页 |
| 3.3 细菌双杂交系统的改进 | 第63-64页 |
| 3.4 改进的细菌双杂交系统的验证 | 第64-65页 |
| 3.5 组学水平鉴定天蓝色链霉菌稳定转录的基因 | 第65-66页 |
| 3.6 天蓝色链霉菌组成型启动子的筛选 | 第66-68页 |
| 3.7 组成型启动子在天蓝色链霉菌中的强度验证 | 第68-70页 |
| 3.8 组成型启动子在委内瑞拉链霉菌和白色链霉菌中的普适性验证 | 第70-73页 |
| 3.9 组成型启动子的应用 | 第73-74页 |
| 3.10 基因芯片分析ActⅡ-orf4基因的时序性 | 第74-75页 |
| 3.11 gfp报告系统检测actⅡ-orf4启动子的时序性 | 第75-76页 |
| 3.11.1 质粒actⅡ-gfp接合转移入S.coelicolor M1146 | 第75页 |
| 3.11.2 S.coelicolor M1146中表征actⅡ-orf4启动子的时序性 | 第75-76页 |
| 3.12 gfp报告系统对异丙基苯甲酸cumate诱导系统的评价 | 第76-83页 |
| 3.12.1 将质粒cumate-gfp接合转移入S.coelicolorM1146菌 | 第76-77页 |
| 3.12.2 cumate诱导表达系统剂量依赖性的评价 | 第77-82页 |
| 3.12.3 cumate诱导系统时间依赖性的评价 | 第82页 |
| 3.12.4 cumate诱导表达系统渗透表达的分析 | 第82-83页 |
| 3.13 cumate诱导表达系统过表达ActⅡ-orf4 | 第83-85页 |
| 3.13.1 将质粒pCumate-actⅡ-4-gfp接合转移入S.colicolor M145 | 第83-84页 |
| 3.13.2 S.colicolor M145菌的生长曲线 | 第84-85页 |
| 3.14 cumate最佳诱导时间和最佳诱导剂量的单因素试验分析 | 第85-86页 |
| 3.14.1 cumate不同诱导剂浓度对放线紫红素Act产量的影响 | 第85页 |
| 3.14.2 不同时间添加cumate诱导剂对Act产量的影响 | 第85-86页 |
| 3.15 正交实验分析 | 第86-88页 |
| 3.15.1 正交试验设计 | 第86-87页 |
| 3.15.2 正交实验结果 | 第87-88页 |
| 3.16 响应面分析 | 第88-89页 |
| 3.17 最佳诱导条件下cumate诱导启动子的转录时序分析 | 第89页 |
| 3.18 S.coelicolor M145菌中与gfp转录时序一致的基因 | 第89-90页 |
| 3.19 基因表达强度统计 | 第90-91页 |
| 3.20 RNA-Seq Operon分析确定启动子的个数 | 第91页 |
| 3.21 与sfgfp的表达强度FPKM值最接近的基因 | 第91页 |
| 3.22 试验验证分析出的生理启动子 | 第91-93页 |
| 4 结论 | 第93-94页 |
| 5 展望 | 第94-95页 |
| 6 参考文献 | 第95-114页 |
| 7 攻读学位期间发表的论文 | 第114-115页 |
| 8 致谢 | 第115页 |
