| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 前言 | 第10-16页 |
| 第一部分 AsnC在布鲁氏菌胞内生存中的作用 | 第16-40页 |
| 1 材料 | 第16-19页 |
| ·菌株、载体、细胞系及培养基 | 第16-17页 |
| ·实验动物 | 第17页 |
| ·主要试剂 | 第17页 |
| ·分子实验所需试剂 | 第17页 |
| ·动物实验所需要的试剂 | 第17页 |
| ·细胞实验所需的试剂 | 第17页 |
| ·主要仪器 | 第17-18页 |
| ·引物 | 第18-19页 |
| 2. 实验方法 | 第19-23页 |
| ·16MA△AsnC突变株的构建 | 第19-21页 |
| ·引物的设计 | 第19页 |
| ·突变盒及突变载体的构建 | 第19-20页 |
| ·16M感受态的制备和电转 | 第20页 |
| ·突变株的筛选与鉴定 | 第20-21页 |
| ·16M△AsnC-C互补株的构建和鉴定 | 第21页 |
| ·互补盒的构建 | 第21页 |
| ·互补株的构建和鉴定 | 第21页 |
| ·AsnC突变株的毒力表型分析 | 第21-23页 |
| ·生长曲线的测定 | 第21-22页 |
| ·体外刺激条件下的生存率 | 第22页 |
| ·布鲁氏菌胞内存活实验 | 第22页 |
| ·小鼠毒力实验 | 第22-23页 |
| 3. 结果 | 第23-35页 |
| ·16M△AsnC突变株的构建和鉴定 | 第23-27页 |
| ·缺失突变株构建的原理 | 第23-24页 |
| ·突变盒的构建 | 第24-25页 |
| ·突变盒的鉴定 | 第25-26页 |
| ·突变株的筛选与鉴定 | 第26-27页 |
| ·互补株的构建和鉴定 | 第27-28页 |
| ·AsnC突变株毒力表型分析 | 第28-35页 |
| ·生长曲线 | 第28页 |
| ·体外应激实验 | 第28-29页 |
| ·16M△AsnC在巨噬细胞内的存活能力 | 第29-30页 |
| ·小鼠毒力实验 | 第30-35页 |
| 4. 讨论 | 第35-40页 |
| ·突变株互补株的构建 | 第35-37页 |
| ·突变盒的构建 | 第35-36页 |
| ·电转的优化 | 第36页 |
| ·突变株和互补株的构建、鉴定分析 | 第36-37页 |
| ·突变株毒力表型分析 | 第37-40页 |
| ·AsnC基因缺失影响布鲁氏菌的生长特性 | 第37页 |
| ·AsnC调控了布鲁氏菌对各种刺激环境中的抵抗和适应 | 第37-38页 |
| ·感染方式和剂量的确定 | 第38页 |
| ·AsnC调控了布鲁氏菌在巨噬细胞和小鼠体内的生存能力 | 第38-40页 |
| 第二部分 AsnC表达及其毒力调控机制 | 第40-52页 |
| 1. 材料 | 第40-41页 |
| ·菌株、细胞系、培养基 | 第40页 |
| ·动物、细胞实验 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40-41页 |
| ·引物 | 第41页 |
| 2 实验方法 | 第41-44页 |
| ·RNA的提取 | 第41-43页 |
| ·感染后小鼠脾脏体内总RNA的提取 | 第41-42页 |
| ·侵染细胞总RNA的提取 | 第42页 |
| ·体外刺激实验细菌的RNA提取 | 第42-43页 |
| ·逆转录 | 第43页 |
| ·DNA酶处理RNA | 第43页 |
| ·cDNA第一链合成(逆转录反应) | 第43页 |
| ·RT-POR | 第43-44页 |
| ·数据分析 | 第44页 |
| 3. 结果和分析 | 第44-49页 |
| ·AsnC在细胞侵染、小鼠感染和体外刺激条件下的表达变化 | 第44-46页 |
| ·细胞侵染过程中AsnC对毒力基因表达的影响 | 第46-47页 |
| ·小鼠感染过程中AsnC对毒力基因表达的影响 | 第47-48页 |
| ·AsnC对布鲁氏菌诱导细胞因子产生的影响 | 第48-49页 |
| 4. 讨论 | 第49-52页 |
| ·AsnC基因的体内为转录分析 | 第49页 |
| ·AsnC基因对毒力基因的影响 | 第49-52页 |
| 第三部分 AsnC家族蛋白的免疫保护作用 | 第52-72页 |
| 1. 实验材料 | 第52-54页 |
| ·培养基 | 第52页 |
| ·菌株及质粒 | 第52页 |
| ·试剂和药品 | 第52-53页 |
| ·缓冲液 | 第53-54页 |
| ·实验动物 | 第54页 |
| ·主要仪器 | 第54页 |
| 2. 实验方法 | 第54-61页 |
| ·引物设计与合成 | 第54-55页 |
| ·克隆载体的构建 | 第55-57页 |
| ·基因的扩增 | 第55-56页 |
| ·酶切和连接 | 第56-57页 |
| ·表达克隆的鉴定 | 第57页 |
| ·重组蛋白表达菌株 | 第57页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第57页 |
| ·SDS-PAGE可溶性分析 | 第57-58页 |
| ·蛋白诱导表达条件的确立 | 第58页 |
| ·蛋白诱导表达温度的确立 | 第58页 |
| ·诱导剂浓度的确立 | 第58页 |
| ·诱导表达时间的确立 | 第58页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第58-60页 |
| ·菌株的培养和诱导 | 第58-59页 |
| ·蛋白纯化步骤 | 第59页 |
| ·透析和浓缩 | 第59-60页 |
| ·蛋白定量 | 第60页 |
| ·蛋白的保护性分析 | 第60-61页 |
| ·分组 | 第60-61页 |
| ·蛋白的免疫与攻毒 | 第61页 |
| 3. 结果 | 第61-68页 |
| ·目的基因的扩增 | 第61-62页 |
| ·表达克隆的鉴定 | 第62-63页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第63-64页 |
| ·目的基因的可溶性 | 第64-65页 |
| ·目的蛋白诱导表达条件的确定 | 第65页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第65-66页 |
| ·蛋白定量 | 第66-67页 |
| ·蛋白的保护性分析 | 第67-68页 |
| ·脾脏 | 第67-68页 |
| ·小鼠脾脏中布鲁氏菌CFU的变化 | 第68页 |
| 4. 讨论 | 第68-72页 |
| ·表达克隆的设计 | 第68-69页 |
| ·目的基因的扩增 | 第69页 |
| ·表达载体的筛选与目的基因的诱导表达 | 第69页 |
| ·蛋白的纯化 | 第69-70页 |
| ·蛋白免疫分析 | 第70-72页 |
| 第四部分 小结 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-78页 |
| 致谢 | 第78-79页 |
