| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 缩略语表 | 第13-15页 |
| 第1章 文献综述 | 第15-25页 |
| ·猪繁殖与呼吸综合征病毒 | 第15-18页 |
| ·PRRS概述 | 第15页 |
| ·PRRSV病原学特征 | 第15-16页 |
| ·PRRSV基因组结构特征 | 第16-17页 |
| ·PRRSV Nsp1β与天然免疫研究进展 | 第17-18页 |
| ·PRRSV与炎症反应 | 第18页 |
| ·CypA及其生物学功能 | 第18-20页 |
| ·CypA与炎症 | 第20-21页 |
| ·CypA与肿瘤 | 第21页 |
| ·CypA与病毒感染 | 第21-23页 |
| ·蛋白质相互作用的研究方法 | 第23-25页 |
| 第2章 研究目的和意义 | 第25-26页 |
| 第3章 材料与方法 | 第26-43页 |
| ·实验材料 | 第26-32页 |
| ·细胞、毒株与菌株 | 第26页 |
| ·载体与质粒 | 第26-27页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第27-28页 |
| ·Western Blot以及CO-IP实验所需材料 | 第28页 |
| ·培养基及其配制 | 第28-30页 |
| ·主要缓冲液与相关试剂及其配制 | 第30-31页 |
| ·构建质粒用缓冲液及其试剂 | 第30页 |
| ·Western Blot用缓冲液及其试剂 | 第30-31页 |
| ·其它缓冲液及其试剂 | 第31页 |
| ·主要实验仪器及设备 | 第31-32页 |
| ·分子生物学分析软件 | 第32页 |
| ·实验方法 | 第32-43页 |
| ·原代PAM细胞的分离 | 第32页 |
| ·PRRSV的扩增(Marc-145及PAM细胞) | 第32页 |
| ·病毒滴度的测定(空斑实验) | 第32-33页 |
| ·抑制剂的配制及其细胞毒性检测 | 第33页 |
| ·细胞样品总RNA的提取、RT-PCR及实时定量PCR | 第33-35页 |
| ·总RNA的提取 | 第33-34页 |
| ·cDNA的合成 | 第34页 |
| ·SYBR Green Ⅰ实时定量PCR | 第34-35页 |
| ·相对mRNA表达水平的计算 | 第35页 |
| ·限制性内切酶酶切反应 | 第35页 |
| ·PCR产物或酶切产物的电泳检测 | 第35页 |
| ·PCR产物或酶切产物的回收与纯化 | 第35页 |
| ·外源DNA片段与质粒载体的连接反应 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第36页 |
| ·连接产物的转化 | 第36-37页 |
| ·重组质粒的制备与鉴定 | 第37页 |
| ·质粒的小量制备 | 第37页 |
| ·质粒的大量制备 | 第37页 |
| ·质粒DNA的定量 | 第37页 |
| ·重组质粒(阳性质粒)的鉴定 | 第37页 |
| ·siRNA和质粒的转染(脂质体介导的瞬时转染法) | 第37-38页 |
| ·双荧光素酶报告基因检测 | 第38页 |
| ·Western Blot检测目的基因在真核细胞中的表达 | 第38-39页 |
| ·样品制备 | 第38页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第38-39页 |
| ·Western Blot检测分析 | 第39页 |
| ·免疫共沉淀 | 第39-40页 |
| ·样品制备及处理 | 第39-40页 |
| ·Western Blot检测互作蛋白 | 第40页 |
| ·间接免疫荧光检测蛋白质的亚细胞定位 | 第40-41页 |
| ·酵母双杂交筛选互作蛋白 | 第41-42页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第41页 |
| ·质粒转化酵母感受态细胞 | 第41-42页 |
| ·酵母融合质粒的自激活检测 | 第42页 |
| ·酵母融合质粒的细胞毒性检测 | 第42页 |
| ·统计学方法 | 第42-43页 |
| 第4章 结果与分析 | 第43-62页 |
| ·PRRSV感染对CypA的影响 | 第43-44页 |
| ·PRRSV感染对CypA表达的影响 | 第43页 |
| ·PRRSV感染对CypA细胞定位的影响 | 第43-44页 |
| ·CypA表达对PRRSV增殖的影响 | 第44-50页 |
| ·猴源CypA真核表达质粒的构建与CypA的表达验证 | 第44-45页 |
| ·猴源CypA干扰分子的合成与验证 | 第45-47页 |
| ·超表达及干扰CypA对PRRSV增殖的影响 | 第47页 |
| ·抑制剂CsA对PRRSV增殖的影响 | 第47-50页 |
| ·CsA对Marc-145和PAM细胞的毒性检测 | 第47-48页 |
| ·Marc-145细胞中CsA对PRRSV增殖的影响 | 第48-49页 |
| ·PAM细胞中CsA对PRRSV增殖的影响 | 第49-50页 |
| ·CsA对PRRSV诱导的炎症反应的影响 | 第50-53页 |
| ·CsA抑制PRRSV感染诱导的MAPK信号通路 | 第50-51页 |
| ·CsA抑制PRRSV感染诱导的炎症因子的表达 | 第51-53页 |
| ·与CypA相互作用的PRRSV编码蛋白的确定 | 第53-55页 |
| ·CypA及PRRSV编码蛋白酵母表达质粒的构建 | 第53-54页 |
| ·与CypA相互作用的PRRSV编码蛋白的筛选 | 第54页 |
| ·CypA与PRRSV Nsp1β相互作用的验证 | 第54-55页 |
| ·与CypA相互作用的PRRSV Nsp1β结构域的确定 | 第55-60页 |
| ·PRRSV Nsp1β截短突变体酵母表达质粒的构建 | 第55-57页 |
| ·与CypA相互作用的PRRSV Nsp1β结构域的筛选 | 第57-58页 |
| ·与CypA相互作用的PRRSV Nsp1β结构域的验证 | 第58-60页 |
| ·相互作用的蛋白及抑制剂CsA对IFN-β启动子活性的影响 | 第60-62页 |
| ·CypA和抑制剂CsA对IFN-β启动子活性的影响 | 第60页 |
| ·PRRSV Nsp1β截短突变体对IFN-β启动子活性的影响 | 第60-62页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第62-66页 |
| ·讨论 | 第62-65页 |
| ·PRRSV感染对CypA表达的影响 | 第62页 |
| ·CypA的表达对PRRSV的影响 | 第62-63页 |
| ·抑制剂CsA对PRRSV诱导的炎症反应的影响 | 第63页 |
| ·CypA与PRRSV相互作用机制的初步研究 | 第63-64页 |
| ·相互作用的蛋白及抑制剂CsA对IFN-β启动子活性的影响 | 第64-65页 |
| ·结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
