| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 缩略语 | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-15页 |
| 1 膜蛋白研究概况 | 第11页 |
| 2 多角体蛋白（Polh）研究概况 | 第11-13页 |
| 3 主要协助转运蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）研究进展 | 第13页 |
| 4 家蚕杆状病毒表达系统研究概况 | 第13-15页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第15-17页 |
| 1 研究目的和意义 | 第15页 |
| 2 研究内容 | 第15-16页 |
| 3 实验流程图 | 第16-17页 |
| 第三章 生物信息学分析 | 第17-21页 |
| 1 生物信息学分析工具 | 第17页 |
| 2 分析结果 | 第17-20页 |
| ·BmMFS 基因序列 | 第17-18页 |
| ·跨膜区预测 | 第18页 |
| ·疏水性分析 | 第18页 |
| ·信号肽预测 | 第18-19页 |
| ·二级结构预测 | 第19页 |
| ·高级结构预测 | 第19-20页 |
| 3 讨论 | 第20-21页 |
| 第四章 BmMFS 的原核表达与抗体制备 | 第21-39页 |
| 1 材料和试剂 | 第21-24页 |
| ·材料 | 第21页 |
| ·试剂 | 第21页 |
| ·试剂配制 | 第21-24页 |
| 2 方法 | 第24-33页 |
| ·家蚕蛹总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成 | 第24-25页 |
| ·家蚕蛹总 RNA 的提取 | 第24-25页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第25页 |
| ·重组质粒 pET-32a-BmMFS 和 pET-32a-Ph20-BmMFS 的构建 | 第25-29页 |
| ·BmMFS 基因的 PCR 扩增 | 第25-26页 |
| ·纯化的 BmMFS 基因、pET-32a 质粒和 pET-32a-Ph20 质粒的双酶切 | 第26-27页 |
| ·BmMFS 基因分别与 pET-32a 质粒、pET-32a-Ph20 质粒的连接 | 第27页 |
| ·TG1 和 E.coli Rosetta 感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·连接产物的转化 | 第27页 |
| ·重组质粒提取 | 第27页 |
| ·PCR 和双酶切鉴定重组质粒 | 第27-29页 |
| ·重组质粒的转化及鉴定 | 第29页 |
| ·Ph20-BmMFS 在大肠杆菌中的诱导表达、纯化和凝血酶酶切分析 | 第29-32页 |
| ·Ph20-BmMFS 在大肠杆菌中的诱导表达 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测 | 第29-30页 |
| ·融合蛋白 Ph20-BmMFS 的 Western blotting 鉴定 | 第30页 |
| ·调节 pH 值纯化 Ph20-BmMFS 蛋白 | 第30-31页 |
| ·镍柱亲和层析进一步纯化 Ph20-BmMFS 蛋白 | 第31页 |
| ·融合蛋白 Ph20-BmMFS 的质谱鉴定 | 第31页 |
| ·Ph20-BmMFS 的凝血酶酶切分析 | 第31-32页 |
| ·抗体制备 | 第32-33页 |
| ·抗原的制备 | 第32页 |
| ·免疫小鼠 | 第32页 |
| ·多克隆鼠抗的制备 | 第32页 |
| ·抗体纯化 | 第32-33页 |
| ·间接 ELISA 测定抗体效价 | 第33页 |
| 3 结果 | 第33-37页 |
| ·重组质粒 pET-32a-BmMFS 和 pET-32a-Ph20-BmMFS 的构建 | 第33页 |
| ·Ph20-BmMFS 的原核表达 | 第33-34页 |
| ·调 pH 值和镍柱亲和层析法纯化融合蛋白 | 第34-35页 |
| ·融合蛋白的质谱鉴定 | 第35-36页 |
| ·融合蛋白 Ph20-BmMFS 的凝血酶切分析 | 第36-37页 |
| ·多抗效价检测 | 第37页 |
| 4 讨论 | 第37-39页 |
| 第五章 Ph20-BmMFS 在家蚕细胞中的表达 | 第39-48页 |
| 1.材料和试剂 | 第39页 |
| ·材料 | 第39页 |
| ·试剂 | 第39页 |
| ·试剂配制 | 第39页 |
| 2 方法 | 第39-44页 |
| ·重组转移载体 pFastBacHTB-Ph20-BmMFS 的构建 | 第39-40页 |
| ·Ph20-BmMFS 片段的 PCR 扩增 | 第39页 |
| ·pFastBacHTB 质粒和 Ph20-BmMFS 片段的双酶切 | 第39-40页 |
| ·连接反应 | 第40页 |
| ·重组 Bacmid-BmMFS 的构建 | 第40-42页 |
| ·DH10Bac 感受态细胞的制备 | 第40-41页 |
| ·重组转移载体 pFastBacHTB-Ph20-BmMFS 的转化 | 第41页 |
| ·重组 Bacmid 的筛选与提取 | 第41页 |
| ·重组 Bacmid 的鉴定 | 第41-42页 |
| ·家蚕 BmN 细胞的复苏和培养 | 第42-43页 |
| ·重组病毒 vPh20-BmMFS 的构建 | 第43页 |
| ·脂质体法转染家蚕 BmN 细胞 | 第43页 |
| ·重组病毒的鉴定 | 第43页 |
| ·病毒滴度测定 | 第43页 |
| ·病毒扩增 | 第43页 |
| ·Ph20-BmMFS 在 BmN 细胞中的表达和鉴定 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-47页 |
| ·重组转移载体 pFastBacHTB-Ph20-BmMFS 的构建 | 第44页 |
| ·重组 Bacmid 的鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组病毒 vPh20-BmMFS 的鉴定 | 第45-46页 |
| ·Ph20-BmMFS 在家蚕 BmN 细胞中的表达和鉴定结果 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 第六章 BmMFS 基因的研究 | 第48-59页 |
| 1 材料与试剂 | 第48页 |
| ·材料 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48页 |
| ·试剂配制 | 第48页 |
| 2 方法 | 第48-52页 |
| ·BmMFS 基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录情况 | 第48-50页 |
| ·荧光定量 PCR 引物的设计 | 第48-49页 |
| ·家蚕五龄幼虫各组织总 RNA 的提取 | 第49页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第49-50页 |
| ·荧光定量 PCR | 第50页 |
| ·BmMFS 蛋白的亚细胞定位 | 第50-51页 |
| ·BmMFS 基因的 RNA 干扰研究 | 第51-52页 |
| ·dsRNA 的合成 | 第51页 |
| ·dsRNA 的体外转录 | 第51页 |
| ·dsRNA 的转染 | 第51-52页 |
| ·MTT 法检测 BmMFS 基因干扰后家蚕 BmN 细胞活力的变化 | 第52页 |
| 3 结果 | 第52-57页 |
| ·BmMFS 基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录情况分析 | 第52-54页 |
| ·家蚕五龄幼虫各组织中内参基因 18SrRNA 和 BmMFS 基因 RT-PCR 曲线分析 | 第52-53页 |
| ·家蚕五龄幼虫各组织中 BmMFS 基因的转录水平分析 | 第53-54页 |
| ·BmMFS 蛋白的亚细胞定位 | 第54-56页 |
| ·BmMFS 基因在家蚕细胞中的 RNA 干扰研究 | 第56-57页 |
| ·dsRNA 的合成 | 第56页 |
| ·BmMFS 基因 RNA 干扰后的 MTT 检测分析 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-59页 |
| 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
