| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-35页 |
| 1 酶定向进化简述 | 第11-14页 |
| ·酶定向进化历史 | 第12-13页 |
| ·酶定向进化基本过程 | 第13-14页 |
| 2 基因文库构建的策略 | 第14-28页 |
| ·基因突变 | 第14-18页 |
| ·易错PCR | 第14-16页 |
| ·盒式PCR 诱变 | 第16-17页 |
| ·随机插入/删除的连交换突变 | 第17页 |
| ·易错滚环扩增法 | 第17页 |
| ·基于遗传密码的随机切除技术 | 第17-18页 |
| ·单分子PCR | 第18页 |
| ·基因重组 | 第18-28页 |
| ·DNA 改组技术 | 第18-20页 |
| ·临时模板随机嵌合生长 | 第20-21页 |
| ·交错延伸重组 | 第21-22页 |
| ·退火寡核苷酸基因改组 | 第22页 |
| ·随机引物体外重组 | 第22-23页 |
| ·渐增切割法产生杂合酶 | 第23-24页 |
| ·非同源序列蛋白重组 | 第24-25页 |
| ·截断状模板重组延伸 | 第25页 |
| ·基于多元PCR 的重组 | 第25-26页 |
| ·结构域重组 | 第26-28页 |
| ·结构域的定义 | 第26页 |
| ·结构域与蛋白质结构 | 第26页 |
| ·组件模型 | 第26-27页 |
| ·结构域与蛋白质分子进化 | 第27页 |
| ·结构域-结构域相互作用 | 第27-28页 |
| ·结构域重组 | 第28页 |
| 3 体外定向进化技术筛选的方法 | 第28-34页 |
| ·常规筛选蛋白质突变体库的方法 | 第29-30页 |
| ·表型观察选择和筛选 | 第29-30页 |
| ·96 孔板筛选 | 第30页 |
| ·表面展示技术 | 第30-34页 |
| ·噬菌体展示技术 | 第30-31页 |
| ·核糖体和mRNA 展示技术 | 第31-32页 |
| ·酵母表面展示技术 | 第32-33页 |
| ·细胞表面展示技术 | 第33-34页 |
| 4 本论文研究的目的和意义 | 第34-35页 |
| 第二章 实验部分 | 第35-53页 |
| 1 组成型表达筛选载体的构建 | 第35-47页 |
| ·实验仪器和试剂 | 第37-39页 |
| ·实验仪器 | 第37页 |
| ·菌株和质粒 | 第37页 |
| ·实验试剂及配制 | 第37-39页 |
| ·实验步骤 | 第39-47页 |
| ·以PBS 克隆载体为母核构建表达载体 | 第41-45页 |
| ·PBS 质粒提取 | 第41-42页 |
| ·启动子的PCR 扩增 | 第42页 |
| ·纯化启动子 | 第42-43页 |
| ·用Kpn I 单酶切启动子 | 第43页 |
| ·用EocR V 和Kpn I 双酶切PBS 质粒 | 第43-44页 |
| ·启动子插入到PBS 质粒 | 第44页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第44-45页 |
| ·重组质粒的转化 | 第45页 |
| ·重组质粒的蓝白斑筛选及鉴定 | 第45页 |
| ·组合表达筛选载体的构建 | 第45-46页 |
| ·pET-24a(+)中酶切位点插入到表达载体 | 第45-46页 |
| ·agaB 基因的PCR 扩增 | 第46页 |
| ·回收、双酶切agaB 基因并插入到载体 | 第46页 |
| ·含有agaB 基因表达载体的转化 | 第46页 |
| ·挑取阳性克隆并鉴定 | 第46页 |
| ·组成型载体功能的检测 | 第46-47页 |
| ·卡那霉素（kana）基因的克隆 | 第46页 |
| ·kana 双酶切产物插入到载体中并转化到感受态细胞 | 第46-47页 |
| ·挑取单克隆并鉴定载体功能 | 第47页 |
| 2 基于模块重组原理建立大容量基因文库 | 第47-53页 |
| ·实验仪器和试剂 | 第48页 |
| ·实验仪器 | 第48页 |
| ·实验试剂及配制 | 第48页 |
| ·实验步骤 | 第48-53页 |
| ·实验流程 | 第48-49页 |
| ·构建基因文库所需序列的设计 | 第49-50页 |
| ·构建基因文库实验条件的优化 | 第50-52页 |
| ·PCR 反应体系模板浓度的优化 | 第51页 |
| ·PCR 反应程序退火温度的优化 | 第51页 |
| ·PCR 反应体系中终止序列比例的优化 | 第51-52页 |
| ·基因文库的鉴定 | 第52-53页 |
| 第三章 实验结果及讨论 | 第53-68页 |
| 1 组成型表达筛选载体的构建 | 第53-60页 |
| ·启动子PCR 扩增结果 | 第53页 |
| ·重组质粒的蓝白斑筛选及双酶切鉴定 | 第53-54页 |
| ·agaB 基因的PCR 扩增 | 第54-55页 |
| ·含有agaB 基因表达载体阳性克隆的鉴定 | 第55-56页 |
| ·kana 基因的克隆 | 第56-57页 |
| ·选择载体功能的鉴定 | 第57-58页 |
| ·构建载体序列图 | 第58-59页 |
| ·小结 | 第59-60页 |
| 2 基于模块重组原理建立大容量基因文库 | 第60-68页 |
| ·重聚PCR 条件的确定 | 第60-63页 |
| ·PCR 反应体系模板浓度的确定 | 第60-61页 |
| ·优化重聚PCR 反应退火温度 | 第61页 |
| ·PCR 反应体系中终止序列比例的确定 | 第61-63页 |
| ·基因文库多样性的鉴定 | 第63-66页 |
| ·小结 | 第66-68页 |
| 结论 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第78-79页 |