| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-33页 |
| ·环糊精概述 | 第14-19页 |
| ·环糊精的组成与结构 | 第14页 |
| ·环糊精的制备 | 第14-16页 |
| ·环糊精的工业应用 | 第16-18页 |
| ·环糊精的发展现状 | 第18-19页 |
| ·CGT 酶概述 | 第19-24页 |
| ·CGT 酶的功能 | 第19-20页 |
| ·CGT 酶的三维结构 | 第20-21页 |
| ·CGT 酶的底物结合 | 第21-22页 |
| ·CGT 酶的转糖苷反应机理 | 第22-23页 |
| ·CGT 酶的环化机理 | 第23-24页 |
| ·CGT 酶发酵生产的研究进展 | 第24-27页 |
| ·在天然菌株中的发酵生产 | 第24-25页 |
| ·在基因工程菌中的发酵生产 | 第25-27页 |
| ·CGT 酶产物特异性的研究进展 | 第27-31页 |
| ·改善产物特异性的意义 | 第27-28页 |
| ·产物特异性影响因素的研究现状 | 第28-31页 |
| ·我国CGT 酶的研究现状及存在问题 | 第31页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第31-33页 |
| 第二章 软化类芽孢杆菌α-CGT 酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第33-47页 |
| ·引言 | 第33页 |
| ·材料与方法 | 第33-38页 |
| ·菌株和质粒 | 第33页 |
| ·试剂和仪器 | 第33-35页 |
| ·培养基 | 第35页 |
| ·DNA 操作 | 第35-37页 |
| ·α-CGT 酶基因的克隆 | 第37页 |
| ·Nco I 位点的突变 | 第37页 |
| ·表达载体pET-20b(+)/cgt 的构建与转化 | 第37-38页 |
| ·表达载体pET-22b(+)/cgt 的构建与转化 | 第38页 |
| ·重组α-CGT 酶的生产 | 第38页 |
| ·分析方法 | 第38页 |
| ·结果与讨论 | 第38-46页 |
| ·表达载体pET-20b(+)/cgt 和pET-22b(+)/cgt 的构建 | 第38-41页 |
| ·大肠杆菌表达系统的构建 | 第41-42页 |
| ·重组酶在E. coli BL21(DE3)(pET-20b(+)/cgt)中的胞外生产 | 第42-44页 |
| ·重组酶在E. coli BL21(DE3)(pET-22b(+)/cgt)中的胞外生产 | 第44-46页 |
| ·本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章采用两阶段温度控制策略提高重组α-CGT 酶的胞外产量 | 第47-61页 |
| ·引言 | 第47页 |
| ·材料与方法 | 第47-49页 |
| ·菌种 | 第47页 |
| ·试剂和仪器 | 第47页 |
| ·重组α-CGT 酶的生产 | 第47-48页 |
| ·重组α-CGT 酶的定位 | 第48页 |
| ·分析方法 | 第48-49页 |
| ·结果和讨论 | 第49-59页 |
| ·在不同诱导温度下重组α-CGT 酶胞外分泌过程 | 第49-50页 |
| ·两阶段诱导温度控制策略的确定 | 第50-51页 |
| ·升温时间对重组α-CGT 酶胞外生产的影响 | 第51-52页 |
| ·两阶段温度控制对重组α-CGT 酶在胞内外分布的影响 | 第52-53页 |
| ·相关机理探讨 | 第53-59页 |
| ·本章小结 | 第59-61页 |
| 第四章甘氨酸与钙离子协同提高重组α-CGT 酶的胞外产量 | 第61-75页 |
| ·引言 | 第61页 |
| ·材料与方法 | 第61-63页 |
| ·菌种 | 第61页 |
| ·试剂和仪器 | 第61-62页 |
| ·重组α-CGT 酶的生产 | 第62页 |
| ·重组α-CGT 酶的定位 | 第62页 |
| ·分析方法 | 第62-63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-73页 |
| ·甘氨酸或钙离子对重组α-CGT 酶胞外分泌的影响 | 第63-65页 |
| ·甘氨酸或钙离子对大肠杆菌细胞膜透性的影响 | 第65-67页 |
| ·甘氨酸或钙离子对大肠杆菌细胞生长的影响 | 第67-69页 |
| ·钙离子能补偿甘氨酸对大肠杆菌细胞生长的抑制作用 | 第69-71页 |
| ·甘氨酸和钙离子同时添加对大肠杆菌细胞膜透性的影响 | 第71-72页 |
| ·甘氨酸和钙离子协同提高重组α-CGT 酶的胞外产量 | 第72-73页 |
| ·本章小结 | 第73-75页 |
| 第五章 重组α-CGT 酶的分离纯化及其生化性质分析 | 第75-86页 |
| ·引言 | 第75页 |
| ·材料与方法 | 第75-78页 |
| ·菌种 | 第75页 |
| ·培养基 | 第75页 |
| ·试剂和仪器 | 第75-76页 |
| ·天然和重组α-CGT 酶的生产 | 第76页 |
| ·天然和重组α-CGT 酶的纯化 | 第76-77页 |
| ·分析方法 | 第77-78页 |
| ·结果与讨论 | 第78-84页 |
| ·天然和重组α-CGT 酶的纯化 | 第78-80页 |
| ·物理性质 | 第80页 |
| ·最适温度和热稳定性 | 第80页 |
| ·最适pH 和pH 稳定性 | 第80-81页 |
| ·二价金属离子对环化活力的影响 | 第81-82页 |
| ·产物特异性 | 第82-83页 |
| ·动力学分析 | 第83-84页 |
| ·本章小结 | 第84-86页 |
| 第六章 亚位点－3 处定点突变提高CGT 酶的α-环糊精特异性 | 第86-96页 |
| ·引言 | 第86页 |
| ·材料与方法 | 第86-89页 |
| ·菌株与质粒 | 第86页 |
| ·试剂和仪器 | 第86-87页 |
| ·DNA 操作 | 第87页 |
| ·突变质粒的构建与转化 | 第87-88页 |
| ·突变体的生产 | 第88页 |
| ·突变体的纯化 | 第88页 |
| ·突变体的晶体结构模拟 | 第88页 |
| ·分析方法 | 第88-89页 |
| ·结果与讨论 | 第89-94页 |
| ·突变CGT 酶的表达与纯化 | 第89页 |
| ·定点突变影响CGT 酶的不同环化活力 | 第89-91页 |
| ·定点突变影响不同环糊精的生产 | 第91-94页 |
| ·定点突变提高CGT 酶的α-环糊精特异性 | 第94页 |
| ·本章小结 | 第94-96页 |
| 第七章 47 位赖氨酸突变提高CGT 酶的β-环糊精特异性 | 第96-105页 |
| ·引言 | 第96页 |
| ·材料与方法 | 第96-98页 |
| ·菌株与质粒 | 第96页 |
| ·试剂和仪器 | 第96页 |
| ·DNA 操作 | 第96页 |
| ·突变体的构建与转化 | 第96-97页 |
| ·突变体的生产 | 第97页 |
| ·突变体的纯化 | 第97页 |
| ·突变体的晶体结构模拟 | 第97页 |
| ·分析方法 | 第97-98页 |
| ·结果与讨论 | 第98-104页 |
| ·多重序列比对 | 第98-99页 |
| ·突变CGT 酶的表达与纯化 | 第99-100页 |
| ·Lys47 对α-环化反应非常重要 | 第100-102页 |
| ·Lys47 突变增加β-环化活力 | 第102页 |
| ·Lys47 突变提高CGT 酶的β-环糊精特异性 | 第102-104页 |
| ·本章小结 | 第104-105页 |
| 结论 | 第105-107页 |
| 论文创新点 | 第107-108页 |
| 致谢 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-123页 |
| 附录1：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第123-125页 |
| 附录2：英文缩写与中文名称对照 | 第125页 |
