| 目录 | 第1-7页 |
| 中文摘要 | 第7-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 前言 | 第11-34页 |
| 1. DNA损伤修复的重要性 | 第11-12页 |
| 2. DNA碱基与核苷酸损伤的修复通路 | 第12-16页 |
| ·碱基损伤的直接回复提供简单而精确的修复 | 第12-13页 |
| ·碱基切除修复利用糖基化酶处理特定类型的碱基异常 | 第13-14页 |
| ·核苷酸切除能够修复多种类型的单点或短片段异常 | 第14-15页 |
| ·错配修复主要参与对抗复制过程的错误参入 | 第15-16页 |
| 3. DNA双链断裂(DSB)损伤应答及修复通路 | 第16-23页 |
| ·双链DNA断裂的发生,识别和信号转导 | 第17-18页 |
| ·非同源末端连接修复的机制 | 第18-20页 |
| ·同源重组修复的机制 | 第20-23页 |
| 4. DSB损伤修复的调节机制 | 第23-28页 |
| ·蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质修饰构成DSBR调控网络的核心 | 第23-26页 |
| ·转录调控构成DSBR调控的另一层次 | 第26页 |
| ·RNA分子可能在DSB修复中发挥作用 | 第26-28页 |
| 5. microRNA分子可能与蛋白质因子构成新的DSBR调控层次 | 第28-33页 |
| ·microRNA的生物合成、作用及其调节DSBR的可能模式 | 第28-30页 |
| ·miR-34s可能调节DSBR相关基因Rad51和SIRT1 | 第30-31页 |
| ·SIRT1在DSBR和细胞生存与凋亡中发挥调节作用 | 第31-32页 |
| ·miR-34a可能和SIRT1形成调控环路 | 第32-33页 |
| 6. 本研究的主要内容 | 第33-34页 |
| 材料与方法 | 第34-66页 |
| 一、实验材料 | 第34-36页 |
| 1. 实验用细胞系、菌株和质粒 | 第34页 |
| 2. 限制性内切酶及其他修饰酶 | 第34页 |
| 3. 抗体 | 第34-35页 |
| 4. 其它主要试剂及试剂盒 | 第35页 |
| 5. 主要仪器设备 | 第35-36页 |
| 二、实验方法 | 第36-66页 |
| 1. 基本技术路线 | 第36-37页 |
| 2. HeLa、293、MCF-7、Saos-2等细胞的培养 | 第37页 |
| ·细胞复苏 | 第37页 |
| ·细胞培养 | 第37页 |
| ·细胞传代和冻存 | 第37页 |
| 3 非病毒方法介导的哺乳动物细胞转染 | 第37-38页 |
| ·转染用质粒DNA的大量制备 | 第37-38页 |
| ·阳离子转染试剂转染细胞 | 第38页 |
| ·电穿孔转染细胞 | 第38页 |
| 4. 逆转录病毒的包装和靶细胞的感染 | 第38-40页 |
| ·FoxO3a RNAi逆转录病毒载体的构建 | 第38-39页 |
| ·逆转录病毒的包装 | 第39页 |
| ·逆转录病毒感染靶细胞 | 第39-40页 |
| 5. 转染后或者逆转录病毒感染后细胞的筛选和克隆细胞株的获得 | 第40页 |
| ·筛选药物的配制 | 第40页 |
| ·混合克隆细胞株的获得 | 第40页 |
| 6. 腺病毒表达载体的构建、包装及靶细胞的感染 | 第40-45页 |
| ·腺病毒表达载体的构建 | 第40-44页 |
| ·腺病毒的包装及靶细胞的感染 | 第44-45页 |
| 7. Pre-miRNA表达载体的构建 | 第45-47页 |
| 8. 3'UTR reporter assay表达载体的构建 | 第47-50页 |
| ·野生型3’UTR reporter assay表达载体的构建 | 第47-49页 |
| ·突变型3’UTR reporter assay表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 9. 双荧光素酶报告系统的检测 | 第50-51页 |
| ·microRNA对相应基因3’UTR的调控作用 | 第50页 |
| ·p53、Fox03a、SIRT1对miR34a和miR34bc启动子区的调控作用 | 第50-51页 |
| ·microRNA34s对DNA单链损伤的修复作用的测定 | 第51页 |
| ·microRNA34s对NHEJ介导的质粒重连的作用测定 | 第51页 |
| 10. microRNA34a的荧光实时定量PCR检测 | 第51-54页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第51-52页 |
| ·逆转录反应获得cDNA的第一条链 | 第52页 |
| ·SYBR Green法检测成熟的miR-34a表达水平 | 第52-54页 |
| 11. microRNA的Northern Blot检测 | 第54-56页 |
| ·电泳及转膜 | 第54-55页 |
| ·杂交 | 第55-56页 |
| ·放射自显影 | 第56页 |
| ·膜的再生 | 第56页 |
| 12. 流式细胞仪测定细胞DNA含量分析细胞周期和细胞凋亡 | 第56-57页 |
| ·收集并固定细胞 | 第56-57页 |
| ·PI染色测定细胞周期 | 第57页 |
| 13. 染色质免疫共沉淀 | 第57-60页 |
| ·ChIP实验所用的各种溶液 | 第57-58页 |
| ·细胞的收集与固定 | 第58页 |
| ·细胞核的提取 | 第58页 |
| ·细胞核的裂解与超声处理 | 第58-59页 |
| ·超声结果的分析 | 第59页 |
| ·免疫沉淀 | 第59页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第59-60页 |
| ·半定量PCR反应 | 第60页 |
| 14. DNA损伤诱导剂及其他蛋白质活性抑制剂处理细胞 | 第60-61页 |
| 15. Western Blot | 第61-63页 |
| ·Western Blot所用的各种溶液 | 第61页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第61-62页 |
| ·转膜 | 第62-63页 |
| ·抗原抗体反应 | 第63页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白 | 第63页 |
| 16.单细胞凝胶电泳(彗星实验)检测DNA双链断裂损伤 | 第63-64页 |
| 17.microRNA 34s系统进化树的构建(Phylogenetic Tree) | 第64-66页 |
| 实验结果 | 第66-90页 |
| 1. miR-34s参与调节DSBR(double Srand Break Repair) | 第66-79页 |
| ·生物信息学方法预测参与DSBR的候选microRNAs | 第66-67页 |
| ·miR-34s表达载体的构建和成熟microRNA的检测 | 第67-68页 |
| ·DNA损伤药物可以激活miR-34a的表达 | 第68-70页 |
| ·miR-34s不影响ssDNA损伤修复 | 第70-71页 |
| ·miR-34s抑制HR介导的DNA修复 | 第71-74页 |
| ·miR-34a抑制基因组DSBs的总体修复活性 | 第74-79页 |
| ·SIRT1是miR-34a的靶基因 | 第74-76页 |
| ·miR-34a不影响NHEJ介导的质粒重连修复 | 第76-77页 |
| ·miR-34a抑制VP16诱导的基因组DSBs的总体修复活性 | 第77-79页 |
| 2. miR-34a在特定细胞类型中促进细胞凋亡的发生 | 第79-82页 |
| 3. miR-34a与SIRT1形成负调控环路 | 第82-90页 |
| ·miR-34b/c和miR-449a/b基因簇由miR-34a进化而来 | 第82-84页 |
| ·miR-34a受到p53和Fox03a的转录调节 | 第84-87页 |
| ·miR-34a受到其靶基因SIRT1的负调节 | 第87-90页 |
| 讨论 | 第90-98页 |
| 1. miR-34s家族具有多个靶基因的特点决定了其可能具有多种调节功能 | 第90-92页 |
| 2. miR-34s的多种调节功能提示其自身表达可能需要协调调控 | 第92-93页 |
| 3. miR-34a与SIRT1形成负调控环路 | 第93-95页 |
| 4. miR-34a与SIRT1所形成负调控环路的意义 | 第95-97页 |
| ·miR-34a与SIRT1形成的调控环路可能对DSBR发挥协同调节的作用 | 第95页 |
| ·miR-34a与SIRT1及转录因子p53和Fox03a构成的调控环路可能参与控制细胞的存活与凋亡 | 第95-97页 |
| 5. 本研究的不足与展望 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-103页 |
| 小结 | 第103-104页 |
| 非论文综述 | 第104-117页 |
| REFERENCES | 第111-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
| 个人简历 | 第118-120页 |
