| 中文摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第8-16页 |
| 1 植物的低温损伤和植物抗寒的分子基础 | 第8-10页 |
| ·植物的低温损伤 | 第8-9页 |
| ·植物抗寒的分子基础 | 第9-10页 |
| 2 植物抗冻蛋白生化特性与功能 | 第10-12页 |
| ·植物抗冻蛋白的生化特性 | 第10-12页 |
| ·植物AFP的生理功能 | 第12页 |
| 3 植物AFP的基因工程研究及抗冻蛋白研究的现状与趋势 | 第12-13页 |
| ·植物AFP的基因工程研究 | 第12-13页 |
| ·植物抗冻蛋白研究的现状与趋势 | 第13页 |
| 4 大肠杆菌pET-30a(+)表达系统 | 第13页 |
| 5 毕赤酵母表达系统 | 第13-14页 |
| 6 本文的研究目的 | 第14-16页 |
| 第二章 雪莲PEBP基因在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第16-33页 |
| 1 实验材料和仪器 | 第17-19页 |
| ·菌种和质粒 | 第17页 |
| ·各种酶试剂及试剂盒 | 第17页 |
| ·其他试剂 | 第17页 |
| ·常用的溶液及缓冲液 | 第17-18页 |
| ·液体和固体培养基 | 第18-19页 |
| ·各种电泳胶的制备 | 第19页 |
| 2 实验方法 | 第19-26页 |
| ·引物设计与合成 | 第19页 |
| ·PCR扩增PEBP基因 | 第19页 |
| ·PEBP基因片段的回收 | 第19-20页 |
| ·pET-PEBP表达载体的构建与鉴定 | 第20-23页 |
| ·重组子在大肠杆菌的诱导表达 | 第23-25页 |
| ·表达产物的纯化和Western杂交 | 第25-26页 |
| 3 实验结果与分析 | 第26-31页 |
| ·PEBP基因的克隆 | 第26-27页 |
| ·pET-PEBP表达载体的构建 | 第27-28页 |
| ·pET 30a(+)质粒的提取及双酶切 | 第28页 |
| ·PEBP片段与表达载体的连接及阳性重组子的筛选 | 第28-29页 |
| ·重组蛋白PEBP在大杆菌中的表达 | 第29-30页 |
| ·表达产物的纯化 | 第30-31页 |
| ·表达产物的Western杂交 | 第31页 |
| 4 讨论 | 第31-33页 |
| 第三章 雪莲PEBP基因在毕赤酵母中的克隆表达及抗冻活性的检测 | 第33-52页 |
| 1 实验材料和仪器 | 第34-35页 |
| ·菌种和质粒 | 第34页 |
| ·各种酶试剂及试剂盒 | 第34页 |
| ·其他试剂 | 第34页 |
| ·常用溶液缓冲液及培养基 | 第34-35页 |
| 2 实验方法 | 第35-41页 |
| ·引物设计与合成 | 第35页 |
| ·PCR扩增PEBP基因及基因片段的回收 | 第35-36页 |
| ·pPIC9K-PEBP质粒的构建与鉴定 | 第36-37页 |
| 方法参照第一章2.4.2 | 第37页 |
| ·pPIC9K-PEBP表达工程菌的制备 | 第37-38页 |
| ·重组酵母表型的鉴定及G418筛选高拷贝转化子 | 第38-39页 |
| ·酵母染色体基因组DNA的提取 | 第39-40页 |
| ·重组酵母诱导表达 | 第40页 |
| ·表达条件的优化 | 第40-41页 |
| ·表达蛋白抗冻活性的简单检测 | 第41页 |
| 3 实验结果 | 第41-50页 |
| ·pPIC9K-PEBP表达载体的构建 | 第41-42页 |
| ·PCR扩增PEBP基因及pPIC9K质粒的提取及双酶切 | 第42-43页 |
| ·PEBP片段与表达载体的连接及阳性重组子的筛选 | 第43-44页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第44-45页 |
| ·电转化及其条件的优化 | 第45页 |
| ·重组酵母表型的鉴定及G418筛选高拷贝转化子 | 第45-46页 |
| ·阳性重组子的筛选 | 第46-47页 |
| ·重组酵母诱导表达及表达条件的优化 | 第47-49页 |
| ·表达蛋白PEBP抗冻性初步研究 | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-52页 |
| 第四章 结论与展望 | 第52-54页 |
| 1 主要结论 | 第52-53页 |
| 2 有待于进一步开展的工作 | 第53页 |
| 3 展望 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 缩写词 | 第59-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 附录一 pET-30a(+)Vevtor | 第62-63页 |
| 附录二 pPIC9K Vevtor | 第63-64页 |
| 作者简介 | 第64页 |
