| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-20页 |
| （一） 乳酸克鲁维酵母表达系统 | 第12-13页 |
| （二） 酵母和哺乳动物细胞N-糖基化修饰途径 | 第13-16页 |
| （三） 酵母糖基人源化研究进展及意义 | 第16-19页 |
| （四） 本研究的目的 | 第19-20页 |
| 第一部分 乳酸克鲁维酵母URA3 营养缺陷型菌株的构建 | 第20-28页 |
| ·实验材料 | 第20-22页 |
| ·菌株、质粒和细胞 | 第20页 |
| ·工具酶、抗体及分子量标准 | 第20页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第20-21页 |
| ·主要仪器及配件 | 第21页 |
| ·主要培养基和溶液 | 第21-22页 |
| ·实验方法 | 第22-25页 |
| ·K. lactis URA3 基因敲除载体的构建 | 第22-24页 |
| ·K. lactis URA3 基因的敲除 | 第24-25页 |
| ·结果 | 第25-28页 |
| ·用于敲除K. lactis URA3 基因载体的构建及其鉴定 | 第26页 |
| ·K. lactis URA3 基因的敲除及其鉴定 | 第26-28页 |
| 第二部分 乳酸克鲁维酵母低糖化表达系统的建立 — OCH1、MNN1 基因的敲除 | 第28-54页 |
| ·实验材料 | 第28-32页 |
| ·菌株、质粒和细胞 | 第28-29页 |
| ·工具酶、抗体及分子量标准 | 第29页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第29页 |
| ·主要仪器及配件 | 第29-30页 |
| ·主要培养基 | 第30页 |
| ·主要溶液 | 第30-32页 |
| ·实验方法 | 第32-42页 |
| ·K. lactis OCH1 基因敲除菌（Kloch1Δ）的构建 | 第32-33页 |
| ·K. lactis OCH1 基因的敲除及其鉴定 | 第33页 |
| ·K. lactis MNN1 基因敲除菌（Kloch1Δ、mnn1Δ）的构建 | 第33-35页 |
| ·K. lactis MNN1 基因的敲除及其鉴定 | 第35页 |
| ·HSA/GM-CSF 表达载体的构建 | 第35-36页 |
| ·HSA/GM-CSF 在乳酸克鲁维酵母野生型和缺陷型菌株中的表达 | 第36-39页 |
| ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的FACE 分析 | 第39页 |
| ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的DSA-FACE 分析 | 第39-42页 |
| ·结果 | 第42-54页 |
| ·用于敲除K. lactis OCH1 或MNN1 基因载体的构建及其鉴定 | 第42页 |
| ·K. lactis OCH1 基因的敲除及其鉴定 | 第42-43页 |
| ·K. lactis MNN1 基因的敲除及其鉴定 | 第43页 |
| ·HSA/GM-CSF 基因的获得 | 第43-44页 |
| ·pKLAC1/HSA/GM-CSF 表达载体的构建 | 第44-45页 |
| ·HSA/GM-CSF 在乳酸克鲁维酵母中的表达及纯化 | 第45-49页 |
| ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖基分析 | 第49-54页 |
| 第三部分 α-1,2-甘露糖苷酶I 在K. lactis KLGE03 菌株内的定位和高效表达 | 第54-74页 |
| ·实验材料 | 第55页 |
| ·植株、菌株和质粒 | 第55页 |
| ·工具酶、抗体及分子量标准 | 第55页 |
| ·主要试剂、主要仪器及配件 | 第55页 |
| ·实验方法 | 第55-63页 |
| ·α-1,2-甘露糖苷酶I（MANI）基因的获得 | 第55-58页 |
| ·MANI 基因定位信号的钓取 | 第58-59页 |
| ·MANI 表达载体的构建 | 第59-61页 |
| ·乳酸克鲁维酵母KLGE03（HSA/GM-CSF）的转化 | 第61-62页 |
| ·pYES2/och1-LAC4-Signal-MANI 酵母转化子的鉴定 | 第62页 |
| ·K. lactis KLGE03-GM-MANI 转化子诱导表达及报告蛋白的纯化 | 第62页 |
| ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的FACE 分析 | 第62页 |
| ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的DSA-FACE 分析 | 第62-63页 |
| ·结果 | 第63-74页 |
| ·α-1,2-甘露糖苷酶I（MANI）基因的获得 | 第63-64页 |
| ·定位信号的获得 | 第64-65页 |
| ·强启动子LAC4 的获得 | 第65页 |
| ·MANI 表达载体的构建及其鉴定 | 第65-69页 |
| ·MANI 的表达及报告蛋白HSA/GM-CSF 的纯化 | 第69-70页 |
| ·MANI 活性鉴定 | 第70-72页 |
| ·小结 | 第72-74页 |
| 结论 | 第74-75页 |
| 讨论 | 第75-80页 |
| 1. Man_5GlcNAc_2 结构的获得为K. lactis 人源化糖基改造提供了重要基础 | 第75-77页 |
| 2. KlOCH1 和KlMNN1 的双敲除提供了一种新型的低糖化表达系统 | 第77页 |
| 3. 两步基因重组技术提供了高效、可重复利用筛选标记来敲除敲入目的基因的方法 | 第77-78页 |
| 4. N-糖链分析技术是酵母糖基工程高通量和快速筛选的基础 | 第78-80页 |
| 附录 | 第80-83页 |
| 1. 主要引物设计序列表 | 第80-81页 |
| 2. 菌株基因型表 | 第81-82页 |
| 3. 缩略词表 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-90页 |
| 致谢 | 第90页 |
