| 缩写表 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-7页 |
| 英文摘要 | 第7-9页 |
| 前言 | 第9-10页 |
| 材料与方法 | 第10-23页 |
| 1 材料 | 第10-11页 |
| 1．1 菌株、质粒和试剂 | 第10页 |
| 1．2 酵母菌培养基 | 第10页 |
| 1．3 LB培养基及常用贮液的配制 | 第10-11页 |
| 2 获得目的基因 | 第11-13页 |
| 2．1 含扣囊复膜孢酵母（S．fibuligera）BGL1的基因片段及其酶切位点 | 第11页 |
| 2．2 引物的设计和合成 | 第11-12页 |
| 2．3 提取S．fibuligera的总DNA | 第12页 |
| 2．4 以SFF和SFR为引物,以S．fibuligera的总DNA为模板进行BGL1基因扩增~[2~4] | 第12页 |
| 2．5 pSFRTV的获得 | 第12页 |
| 2．6 pSHLTV的获得 | 第12-13页 |
| 3 重组质粒pSHL9K的获得 | 第13-15页 |
| 3．1 pPIC9K多克隆位点（mcs）及其结构图 | 第13-15页 |
| 3．2 pSHL9K的构建 | 第15页 |
| 4 电转化PichiaGS | 第15-16页 |
| 5 重组毕赤酵母的鉴定和多拷贝转化子的筛选 | 第16-17页 |
| 5．1 重组毕赤酵母的鉴定 | 第16-17页 |
| 5．1．1 甲醇利用型的鉴定 | 第16页 |
| 5．1．2 插入目的基因的阳性转化子的鉴定 | 第16-17页 |
| 5．2 多拷贝转化子的筛选 | 第17页 |
| 6 S．fibuligeraBGL1基因在毕赤氏酵母（Pichiapastoris）中的表达 | 第17-18页 |
| 7 重组毕赤氏酵母BGL1基因表达产物的鉴定 | 第18-19页 |
| 7．1 S．fibuligeraBGL1的表达产物，即（-葡萄糖苷酶（BGLI）的氨基酸序列及个数 | 第18页 |
| 7．2 蛋白质含量测定 | 第18-19页 |
| 7．3 蛋白质SDS－PAGE的方法 | 第19页 |
| 7．4β-葡萄糖苷酶活性检测 | 第19页 |
| 8 重组蛋白表达条件的优化 | 第19页 |
| 9 基本实验方法 | 第19-23页 |
| 9．1 E．coliDH5α感受态细胞制备及转化方法 | 第19-20页 |
| 9．2 E．coli质粒的提取 | 第20-21页 |
| 9．3 质粒的酶切，CIP脱磷酸反应及DNA片段的连接 | 第21-22页 |
| 9．4 DNA片段的回收 | 第22页 |
| 9．5 PCR扩增 | 第22页 |
| 9．6 PCR产物纯化、连接、转化及阳性克隆的筛选 | 第22页 |
| 9．7 序列测定及序列 | 第22-23页 |
| 结果与讨论 | 第23-38页 |
| 1 结果 | 第23-35页 |
| 1．1 BGL1基因的获得 | 第23-24页 |
| 1．1．1 S．fibuligera总DNA的获得 | 第23页 |
| 1．1．2 目的基因的获得 | 第23-24页 |
| 1．2 重组质粒pSFRTV的构建 | 第24-25页 |
| 1．3 重组质粒pSHLTV的构建 | 第25-26页 |
| 1．4 重组表达质粒pSHL9K的构建及鉴定 | 第26-28页 |
| 1．5 电转化结果及重组Pichiapastoris菌株的鉴定 | 第28-29页 |
| 1．6 BGL1基因在Pichiapastoris菌株GS115中的表达 | 第29-35页 |
| 1．6．1 含多拷贝目的基因的菌株获得 | 第29页 |
| 1．6．2 SDS-PAGE及目的蛋白的分子量测定 | 第29-31页 |
| 1．6．3 表达产物中蛋白含量的测定 | 第31-33页 |
| 1．6．4 表达产物的酶活性测定及酶活性质的鉴定 | 第33-34页 |
| 1．6．5 重组蛋白表达条件的优化结果 | 第34-35页 |
| 2 讨论 | 第35-38页 |
| 2．1 研究目的和意义 | 第35-36页 |
| 2．2 关于实验方法 | 第36-37页 |
| 2．3 实验结论 | 第37-38页 |
| 参考文献（Referrence) | 第38-42页 |
| 致谢 | 第42-43页 |
| 文献综述β-葡萄糖苷酶、毕赤酵母表达系统和抗肿瘤细胞因子的研究进展 | 第43-58页 |
| 1β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）研究进展 | 第43-47页 |
| 1．1β-Glucosidas的生态分布 | 第43-44页 |
| 1．2β-Glucosidase的结构特征 | 第44页 |
| 1．3 影响β-Glucosidase活性的因素 | 第44页 |
| 1．4β-Glucosidase的作用模式 | 第44-46页 |
| 1．5β-Glucosidase的活性测定 | 第46页 |
| 1．6β-Glucosidase的应用 | 第46页 |
| 1．7β-Glucosidase在异源宿主中的表达 | 第46-47页 |
| 1．8 S．fibuligera的β-glucosidase研究进展 | 第47页 |
| 1．9β-Glucosidase在肿瘤诊断和治疗方面的研究 | 第47页 |
| 2 巴斯德毕赤氏酵母（Pichiapastoris）表达系统 | 第47-56页 |
| 2．1 甲醇酵母表达系统的优点 | 第48页 |
| 2．2 甲醇酵母的生物学 | 第48-49页 |
| 2．3 受体菌和载体 | 第49-50页 |
| 2．4 甲醇酵母的转化 | 第50-51页 |
| 2．5 甲醇酵母中表达蛋白的一般步骤 | 第51-52页 |
| 2．5．1 载体的选择 | 第51页 |
| 2．5．2 克隆 | 第51页 |
| 2．5．3 重组载体的线性 | 第51页 |
| 2．5．4 转化 | 第51页 |
| 2．5．5 筛选 | 第51-52页 |
| 2．5．6 鉴定表型 | 第52页 |
| 2．5．7 诱导表达 | 第52页 |
| 2．6 影响甲醇酵母中外源蛋白表达的因素 | 第52-56页 |
| 2．6．1 外源基因序列的内在特性 | 第52-53页 |
| 2．6．2 表达条件 | 第53-56页 |
| 2．7 外源蛋白的纯化 | 第56页 |
| 3 抗肿瘤细胞因子的研究进展 | 第56-58页 |
| 3．1 抗肿瘤细胞因子的抗癌机理 | 第56-57页 |
| 3．2 抗肿瘤细胞因子的常用治疗方法 | 第57-58页 |
| 3．2．1 直接运用抗肿瘤细胞因子进行治疗 | 第57页 |
| 3．2．2 免疫基因治疗的方法 | 第57-58页 |
| 3．2．2．1 细胞因子基因转染肿瘤细胞 | 第57页 |
| 3．2．2．2 细胞因子基因转染效应细胞 | 第57-58页 |
| 参考文献（Reference) | 第58-63页 |
