| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-16页 |
| 附图清单 | 第16-19页 |
| 附表清单 | 第19-20页 |
| 主要缩略词和符号表 | 第20-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-38页 |
| 第一节 昆虫病原真菌致病机理研究进展 | 第21-31页 |
| 1 可用于生防的昆虫病原真菌种类 | 第22-23页 |
| 2 昆虫病原真菌的侵染过程 | 第23-31页 |
| ·分生孢子附着于寄主体表 | 第24页 |
| ·附着的分生孢子产生胞外酶 | 第24-30页 |
| ·蛋白质降解酶 | 第24-27页 |
| ·几丁质降解酶 | 第27-30页 |
| ·萌发的孢子侵入寄主昆虫体内 | 第30-31页 |
| ·昆虫病原真菌在寄主血腔中生长 | 第31页 |
| 第二节 昆虫病原真菌基因工程研究 | 第31-36页 |
| 1 虫生真菌毒力基因工程的研究 | 第32-33页 |
| 2 基因克隆相关技术 | 第33-34页 |
| 3 昆虫病原真菌的遗传转化方法 | 第34-35页 |
| ·选择标记基因 | 第34页 |
| ·遗传转化方法 | 第34-35页 |
| 4 总结与展望 | 第35-36页 |
| 第三节 真核表达研究进展 | 第36-38页 |
| 1 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统简介 | 第36-38页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的生物学特性 | 第36页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的优点 | 第36-37页 |
| ·应用前景 | 第37-38页 |
| 第二章 引言 | 第38-40页 |
| 第三章 高产蛋白酶菌株的筛选及菌株几丁质酶产酶条件的优化 | 第40-54页 |
| 1 引言 | 第40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-45页 |
| ·材料 | 第40-42页 |
| ·供试菌株及其来源 | 第40-41页 |
| ·主要试剂 | 第41页 |
| ·培养基 | 第41页 |
| ·主要仪器 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-45页 |
| ·Tris-HCl缓冲液的配制 | 第42页 |
| ·发酵液的制备 | 第42页 |
| ·蛋白酶活力的测定 | 第42页 |
| ·胶体几丁质的制备 | 第42页 |
| ·对二甲氨基苯甲醛(DMAB)的配置 | 第42页 |
| ·四硼酸钾溶液的配制 | 第42-43页 |
| ·NAG标准曲线的制定 | 第43页 |
| ·几丁质酶酶活测定 | 第43-44页 |
| ·高产蛋白酶菌株的筛选 | 第44页 |
| ·几丁质酶产酶曲线 | 第44页 |
| ·几丁质酶产生条件的研究 | 第44-45页 |
| ·碳源对产酶的影响 | 第44页 |
| ·氮源对产酶的影响 | 第44页 |
| ·金属离子对产酶的影响 | 第44页 |
| ·培养基初始pH对产酶的影响 | 第44页 |
| ·培养温度对产酶的影响 | 第44页 |
| ·接种量对产酶的影响 | 第44-45页 |
| ·装液量对产酶的影响 | 第45页 |
| 3 结果与分析 | 第45-52页 |
| ·高蛋白酶酶活力菌株的筛选 | 第45-46页 |
| ·玫烟色棒束孢产几丁质酶曲线 | 第46页 |
| ·培养基条件对产酶的影响 | 第46-50页 |
| ·碳源对产酶的影响 | 第46-47页 |
| ·氮源对产酶的影响 | 第47-48页 |
| ·金属离子对产酶的影响 | 第48页 |
| ·培养基起始pH对产酶的影响 | 第48-49页 |
| ·发酵培养基的正交试验设计 | 第49-50页 |
| ·培养条件对产酶的影响 | 第50-52页 |
| ·发酵温度对产酶的影响 | 第50-51页 |
| ·接种量对产酶的影响 | 第51页 |
| ·通气量对玫烟色棒束孢产酶的影响 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 第四章 玫烟色棒束孢胞类枯草杆菌蛋白酶基因Ifupr1及其上游调控序列的克隆与分析 | 第54-79页 |
| 1 引言 | 第54页 |
| 2 材料与方法 | 第54-67页 |
| ·材料 | 第54-57页 |
| ·菌株与载体 | 第54页 |
| ·主要化学试剂 | 第54页 |
| ·主要的培养基 | 第54-55页 |
| ·常用的缓冲液和贮藏液 | 第55页 |
| ·主要的仪器设备 | 第55-57页 |
| ·方法 | 第57-67页 |
| ·发酵液的制备 | 第57页 |
| ·cDNA克隆及其全序列分析 | 第57-62页 |
| ·总RNA的提纯 | 第57-58页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第58-59页 |
| ·cDNA的特异片段的RT-PCR扩增 | 第59页 |
| ·PCR产物割胶回收 | 第59-60页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第60页 |
| ·克隆转化 | 第60-61页 |
| ·阳性克隆的菌落PCR验证 | 第61-62页 |
| ·序列测定与分析 | 第62页 |
| ·RACE法扩增基因cDNA的末端序列 | 第62-64页 |
| ·RACE模板的合成 | 第62页 |
| ·cDNA3'/5'端的RACE-PCR扩增 | 第62-64页 |
| ·序列分析 | 第64页 |
| ·蛋白酶同源性和系统发育分析 | 第64页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第64-65页 |
| ·cDNA全长验证及结构基因的获得 | 第65页 |
| ·DNA步移法扩增Ifupr1a基因5'-上游区序列 | 第65-67页 |
| ·1st PCR反应 | 第66页 |
| ·2nd PCR反应 | 第66-67页 |
| ·3rd PCR反应 | 第67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-77页 |
| ·RNA的提取 | 第67-68页 |
| ·RT-PCR得到基因特异性片段 | 第68-69页 |
| ·玫烟色棒束孢蛋白酶基因全长cDNA的克隆及序列分析 | 第69-70页 |
| ·玫烟色棒束孢Ifupr1a基因cDNA序列分析 | 第70-71页 |
| ·玫烟色棒束孢Ifupr1a基因同源性的比较 | 第71-73页 |
| ·不同真菌来源蛋白酶的系统发育分析 | 第73页 |
| ·IFUPR1高级结构预测和分析 | 第73-74页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第74页 |
| ·cDNA全长序列的验证与结构基因的获得 | 第74-75页 |
| ·Ifupr1a基因上游序列的克隆与分析 | 第75-77页 |
| 4 讨论 | 第77-79页 |
| 第五章 玫烟色棒束孢几丁质酶基因Ifuchi1的cDNA和上游序列克隆与分析 | 第79-92页 |
| 1 引言 | 第79页 |
| 2 材料与方法 | 第79-81页 |
| ·菌株来源 | 第79页 |
| ·方法 | 第79-81页 |
| ·玫烟色棒束孢几丁质酶基因cDNA的特异片段扩增 | 第79-80页 |
| ·PCR产物回收克隆测序 | 第80页 |
| ·cDNA3'/5'端的RACE-PCR扩增 | 第80页 |
| ·几丁质酶同源性和系统发育分析 | 第80-81页 |
| ·cDNA全长验证及结构基因的获得 | 第81页 |
| ·DNA步移法扩增Ifuchi1a基因5'-上游区序列 | 第81页 |
| ·序列分析 | 第81页 |
| 3 结果与分析 | 第81-90页 |
| ·RT-PCR得到基因特异性片段 | 第81-82页 |
| ·玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchi1a基因全长cDNA的克隆及序列分析 | 第82-83页 |
| ·玫烟色棒束孢Ifuchi1a基因cDNA序列分析 | 第83-85页 |
| ·玫烟色棒束孢Ifuch1a基因编码氨基酸的特征分析 | 第85-86页 |
| ·cDNA全长序列的验证与结构基因的获得 | 第86页 |
| ·不同真菌来源几丁质酶的系统发育分析 | 第86-87页 |
| ·Ifuchi1a基因上游序列的克隆与分析 | 第87-89页 |
| ·IFUCHI1A二级结构预测和分析 | 第89页 |
| ·IFUCHI1A三级结构预测和分析 | 第89-90页 |
| 4 讨论 | 第90-92页 |
| 第六章 玫烟色棒束孢蛋白酶与几丁质酶转基因球孢白僵菌菌株的获得及其对马尾松毛虫毒力增效作用 | 第92-110页 |
| 1 引言 | 第92-93页 |
| 2 材料与方法 | 第93-101页 |
| ·材料 | 第93页 |
| ·菌株来源 | 第93页 |
| ·主要试剂 | 第93页 |
| ·主要培养基 | 第93页 |
| ·方法 | 第93-97页 |
| ·pBARGPE-Ifupr1与pBARGPE-Ifuchi1表达载体的构建 | 第93-94页 |
| ·Ifupr1插入片段的扩增 | 第93-94页 |
| ·Ifuchi1插入片段的扩增 | 第94页 |
| ·目标片段酶切及纯化 | 第94-95页 |
| ·表达载体pBARGPE1的制备 | 第95-96页 |
| ·pBARGPE1质粒的提取 | 第95页 |
| ·pBARGPE1质粒的酶切 | 第95-96页 |
| ·去磷酸化与回收 | 第96页 |
| ·连接与转化 | 第96页 |
| ·菌落PCR验证 | 第96-97页 |
| ·酶切验证 | 第97页 |
| ·制备芽生孢子法转化球孢白僵菌 | 第97-100页 |
| ·芽生孢子的制备 | 第97-98页 |
| ·芽生孢子的转化 | 第98页 |
| ·球孢白僵菌基因组DNA的提取 | 第98-99页 |
| ·真菌转化子的PCR初步筛选与验证 | 第99-100页 |
| ·生物测定 | 第100页 |
| ·菌种与菌剂 | 第100页 |
| ·供试昆虫 | 第100页 |
| ·处理方法 | 第100页 |
| ·酶活测定 | 第100页 |
| ·数据统计与分析 | 第100-101页 |
| 3 结果与分析 | 第101-108页 |
| ·目标基因的扩增 | 第101页 |
| ·菌落PCR验证 | 第101页 |
| ·酶切验证 | 第101-102页 |
| ·真菌转化子的PCR筛选与验证 | 第102-103页 |
| ·松毛虫感染症状 | 第103页 |
| ·菌株酶活测定 | 第103-104页 |
| ·蛋白酶酶活测定 | 第103页 |
| ·几丁质酶酶活测定 | 第103-104页 |
| ·致死中时间的生物测定 | 第104-106页 |
| ·转玫烟色蛋白酶基因球孢白僵菌对马尾松毛虫致死中时间的生物测定 | 第104-105页 |
| ·转玫烟色几丁质酶基因球孢白僵菌对马尾松毛虫致死中时间的生物测定 | 第105-106页 |
| ·致死中浓度的生物测定 | 第106-108页 |
| ·转玫烟色蛋白酶基因球孢白僵菌对马尾松毛虫致死中时间的生物测定 | 第106-107页 |
| ·转玫烟色几丁质酶基因球孢白僵菌对马尾松毛虫致死中时间的生物测定 | 第107-108页 |
| 4 讨论 | 第108-110页 |
| 第七章 玫烟色棒束孢蛋白酶基因Ifupr1和几丁质酶基因Ifuchi1在毕赤酵母中表达 | 第110-126页 |
| 1 引言 | 第110页 |
| 2 材料与方法 | 第110-119页 |
| ·材料 | 第110-112页 |
| ·菌株 | 第110页 |
| ·主要试剂 | 第110页 |
| ·毕赤酵母表达各种母液的配制 | 第110-111页 |
| ·SDS-PAGE电泳使用溶液的配制 | 第111-112页 |
| ·方法 | 第112-117页 |
| ·Ifuchi1与Ifuchi1目标片段的扩增 | 第112-114页 |
| ·Ifupr1插入片段的扩增 | 第112-113页 |
| ·Ifuchi1插入片段的扩增 | 第113页 |
| ·PCR产物的酶切 | 第113-114页 |
| ·表达载体pPIC9K的制备 | 第114页 |
| ·pPIC9K质粒的提取 | 第114页 |
| ·pPIC9K质粒的酶切 | 第114页 |
| ·质粒与目的片段DNA的连接 | 第114-115页 |
| ·菌落PCR验证 | 第115页 |
| ·酵母表达载体pPIC9K-Ifupr1与pPIC9K-Ifuchi1的酶切鉴定 | 第115-116页 |
| ·单酶切线性化 | 第116页 |
| ·线状质粒DNA的脱磷酸化处理 | 第116-117页 |
| ·毕赤酵母菌株的分离纯化 | 第117页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第117-118页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备 | 第117页 |
| ·电击转化 | 第117-118页 |
| ·Pichi酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 | 第118页 |
| ·重组酵母的诱导表达 | 第118-119页 |
| ·多拷贝His~+Mut~S克隆的筛选 | 第118页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第118-119页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE分离与纯化 | 第119页 |
| 3 结果与分析 | 第119-124页 |
| ·目标基因的扩增 | 第119-120页 |
| ·插入基因片段的菌落PCR验证 | 第120页 |
| ·酵母表达载体pPIC9K-Ifupr1与pPIC9K-Ifuchi1的酶切鉴定 | 第120-121页 |
| ·单酶切线性化 | 第121页 |
| ·Pichia酵母表达重组子直接PCR鉴定 | 第121-122页 |
| ·毕赤酵母菌株单菌落的获得 | 第122-123页 |
| ·重组毕赤酵母的筛选及鉴定 | 第123-124页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达及其产物的SDS-PAGE分析 | 第124页 |
| 4 讨论 | 第124-126页 |
| 第八章 总结 | 第126-128页 |
| 第九章 创新点 | 第128-129页 |
| 参考文献 | 第129-139页 |
| 致谢 | 第139-140页 |
| 个人简介 | 第140页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第140页 |
