| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-36页 |
| ·甾体化合物及其微生物转化 | 第14-20页 |
| ·甾体化合物及甾体药物 | 第14-16页 |
| ·甾体化合物的微生物转化 | 第16-20页 |
| ·甾体化合物的微生物转化概述 | 第16-17页 |
| ·甾体化合物微生物转化的反应类型 | 第17页 |
| ·植物甾醇及甾醇侧链降解 | 第17-20页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD) | 第20-24页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢反应概况 | 第20-21页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶的反应机理 | 第21-22页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶氨基酸序列分析 | 第22-23页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶的异源表达 | 第23-24页 |
| ·3-甾酮-9A-羟基化酶(KSH) | 第24-28页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化反应概况 | 第24-25页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶的酶学分类 | 第25-27页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶的抑制 | 第27-28页 |
| ·分枝杆菌降解甾醇侧链的国内外相关研究现状及最新发展动态分析 | 第28-33页 |
| ·分枝杆菌概况及在甾体代谢上的研究 | 第28-29页 |
| ·国内外相关研究现状 | 第29-31页 |
| ·菌种选育 | 第29-30页 |
| ·培养基优化 | 第30页 |
| ·发酵系统的研究 | 第30-31页 |
| ·甾醇降解机制最新发展动态分析 | 第31-33页 |
| ·构建甾醇降解基因工程菌的研究进展 | 第33页 |
| ·本课题的研究目的与内容 | 第33-36页 |
| ·课题背景 | 第33-35页 |
| ·本课题的研究内容及目标 | 第35-36页 |
| 第2章 新金分枝杆菌NwIB-01的筛选鉴定、生长特性研究 | 第36-50页 |
| ·引言 | 第36页 |
| ·材料与方法 | 第36-42页 |
| ·实验材料 | 第36-38页 |
| ·实验药品及仪器 | 第36-37页 |
| ·菌株 | 第37页 |
| ·培养基 | 第37-38页 |
| ·实验方法 | 第38-42页 |
| ·植物甾醇的乳化 | 第38页 |
| ·微生物的富集、分离与纯培养 | 第38-39页 |
| ·转化产物分析 | 第39页 |
| ·菌种鉴定 | 第39-41页 |
| ·菌种生长分析 | 第41-42页 |
| ·结果与分析 | 第42-48页 |
| ·微生物筛选鉴定 | 第42-46页 |
| ·微生物的形态观察 | 第42-43页 |
| ·NwIB-01的植物甾醇转化实验 | 第43-44页 |
| ·微生物的16SrDNA鉴定 | 第44-46页 |
| ·NwIB-01的生长特性及培养基选择 | 第46-48页 |
| ·本章小结 | 第48-50页 |
| 第3章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-酮-4-烯类固醇化合物C_(1,2)位脱氢反应关键基因的克隆和酶学分析 | 第50-79页 |
| ·引言 | 第50页 |
| ·材料与方法 | 第50-66页 |
| ·实验材料 | 第50-54页 |
| ·菌株及质粒 | 第50-51页 |
| ·培养基及试剂 | 第51-53页 |
| ·实验药品及仪器 | 第53-54页 |
| ·实验方法 | 第54-66页 |
| ·菌种保藏 | 第55页 |
| ·染色体DNA的制备 | 第55页 |
| ·大肠杆菌质粒质粒DNA的提取 | 第55-56页 |
| ·DNA片段的凝胶电泳回收 | 第56页 |
| ·小量PCR产物的纯化 | 第56页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第56-57页 |
| ·T载体克隆 | 第57页 |
| ·转化和筛选 | 第57页 |
| ·阳性重组子的鉴定 | 第57-58页 |
| ·引物设计 | 第58页 |
| ·基因走读Genome-Walking及基因全长的获得 | 第58-60页 |
| ·表达质粒的构建 | 第60-61页 |
| ·蛋白质的原核表达及SDS-PAGE检测 | 第61-62页 |
| ·重组菌诱导优化 | 第62-63页 |
| ·大肠杆菌细胞破碎 | 第63页 |
| ·Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化 | 第63页 |
| ·透析 | 第63-64页 |
| ·总蛋白含量测定 | 第64-65页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶酶活测定 | 第65页 |
| ·基因工程大肠杆菌转化AD实验 | 第65页 |
| ·基因序列的简单生物信息学分析 | 第65-66页 |
| ·结果与分析 | 第66-77页 |
| ·NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶基因保守序列的克隆 | 第66-68页 |
| ·分枝杆菌基因组提取方法改进 | 第66-67页 |
| ·分枝杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶保守序列的扩增 | 第67-68页 |
| ·NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶基因全序列的克隆 | 第68-70页 |
| ·构建pET-22b-ksdD_M和pET-32a-ksdD_M表达载体 | 第70-71页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶的优化表达 | 第71-74页 |
| ·重组pET-22b-ksdD_M和pET-32a-ksdD_M的诱导表达 | 第71-72页 |
| ·表达条件的优化 | 第72-73页 |
| ·蛋白纯化 | 第73-74页 |
| ·酶活测定 | 第74页 |
| ·大肠杆菌全细胞转化实验 | 第74-75页 |
| ·生物信息学分析 | 第75-77页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶的基因分析 | 第75-76页 |
| ·3-甾酮-△~1-脱氢酶的跨膜结构分析 | 第76-77页 |
| ·本章小结 | 第77-79页 |
| 第4章 新金分枝杆菌NwIB-01中甾体9α-羟基化反应关键基因的克隆和酶学分析 | 第79-99页 |
| ·引言 | 第79页 |
| ·材料与方法 | 第79-84页 |
| ·实验材料 | 第79-80页 |
| ·实验方法 | 第80-84页 |
| ·常规分子生物学实验方法 | 第80页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)的引物设计 | 第80-81页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)的保守序列的扩增 | 第81页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶的染色体走读 | 第81页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶全长基因的克隆 | 第81-82页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)保守序列的扩增 | 第82页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)全长序列的克隆 | 第82页 |
| ·重组质粒的构建 | 第82页 |
| ·重组pET32-ksh的诱导表达 | 第82-83页 |
| ·表达产物鉴定 | 第83页 |
| ·表达蛋白KshA的分离纯化 | 第83页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶基因的共表达 | 第83-84页 |
| ·结果与分析 | 第84-97页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶基因保守序列的扩增 | 第84页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶基因全长的克隆 | 第84-85页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶序列及进化树分析 | 第85-90页 |
| ·开放阅读框(ORF)的确定及蛋白一级结构分析 | 第85-87页 |
| ·KshA的二级结构及结构域预测 | 第87-89页 |
| ·基因进化树及保守结构域分析 | 第89-90页 |
| ·重组质粒的构建及转化 | 第90-91页 |
| ·KSH的诱导表达优化及蛋白纯化 | 第91-92页 |
| ·全菌转化 | 第92页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶(KshB)基因的克隆 | 第92-93页 |
| ·3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶的共表达 | 第93-97页 |
| ·本章小结 | 第97-99页 |
| 第5章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-甾酮-9α-羟基化酶(KshA)及3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD)的基因敲除 | 第99-117页 |
| ·引言 | 第99页 |
| ·材料与方法 | 第99-107页 |
| ·实验材料 | 第99-101页 |
| ·菌株和质粒 | 第99-100页 |
| ·实验试剂及器材 | 第100-101页 |
| ·实验方法 | 第101-107页 |
| ·KsdD自杀敲除质粒的构建 | 第101-103页 |
| ·KsdD敲除工程菌阳性克隆子的筛选 | 第103-106页 |
| ·KSH自杀敲除质粒的构建 | 第106-107页 |
| ·KSH敲除工程菌阳性克隆子的筛选 | 第107页 |
| ·KsdD及KshA基因敲除工程菌的验证 | 第107页 |
| ·实验结果 | 第107-116页 |
| ·KsdD上下游序列的扩增 | 第107-109页 |
| ·KsdD敲除质粒的构建 | 第109-110页 |
| ·KsdD基因敲除突变菌的筛选 | 第110-111页 |
| ·KsdD基因敲除突变菌的表型及生产特征鉴定 | 第111-113页 |
| ·KshA基因上下游序列的克隆及敲除质粒的构建 | 第113-116页 |
| ·本章小结 | 第116-117页 |
| 第6章 新金分枝杆菌NwIB-01中3-甾酮-△~1-脱氢酶(KsdD)的基因强化表达及基因工程菌ADD发酵试验初探 | 第117-127页 |
| ·引言 | 第117页 |
| ·材料与方法 | 第117-120页 |
| ·实验材料 | 第117-118页 |
| ·菌株和质粒 | 第117-118页 |
| ·实验试剂及器材 | 第118页 |
| ·实验方法 | 第118-120页 |
| ·KsdD穿梭表达质粒(pMV261-ksdDM)的构建 | 第118-119页 |
| ·KsdD整合表达质粒(pMV306-ksdDM)的构建 | 第119-120页 |
| ·重组分枝杆菌的构建 | 第120页 |
| ·重组分枝杆菌的稳定性分析 | 第120页 |
| ·重组分枝杆菌NwIB-04的发酵初探 | 第120页 |
| ·重组分枝杆菌NwIB-04的转化反应及产物分析 | 第120页 |
| ·实验结果与分析 | 第120-125页 |
| ·重组质粒pMV261-ksdD_M的构建 | 第120-121页 |
| ·重组质粒pMV306-ksdD_M的构建 | 第121-122页 |
| ·重组分枝杆菌重组子的鉴定 | 第122-123页 |
| ·重组分枝杆菌的稳定性分析 | 第123页 |
| ·重组分枝杆菌NwIB-04的性状检测及发酵放大实验 | 第123-125页 |
| ·本章小结 | 第125-127页 |
| 第7章 课题最新进展及结论与展望 | 第127-134页 |
| ·课题最新进展-甾体降解基因簇的研究 | 第127-130页 |
| ·结论 | 第130-132页 |
| ·课题研究展望 | 第132-134页 |
| 参考文献 | 第134-143页 |
| 致谢 | 第143-144页 |
| 博士期间发表的论文与专利 | 第144-145页 |
| 附录一 缩写词和英汉对照 | 第145-146页 |
| 附录二 NCBI提交序列信息 | 第146-151页 |
