| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 1 文献综述 | 第14-22页 |
| ·玉米矮花叶病的危害 | 第14页 |
| ·玉米矮花叶病抗性遗传研究 | 第14-15页 |
| ·RNA干扰在抗病毒基因工程中的应用 | 第15-17页 |
| ·RNA干扰在抗病毒基因工程中的优势 | 第17-18页 |
| ·RNA干扰抗病毒目的基因的选择 | 第18-19页 |
| ·玉米遗传转化受体及分化再生系统 | 第19-20页 |
| ·本研究立题依据及主要研究内容 | 第20-22页 |
| 2 材料和方法 | 第22-48页 |
| ·RNA干扰目的基因的选择和克隆 | 第22页 |
| ·反向重复序列中间载体的构建 | 第22-30页 |
| ·目的片段PCR扩增 | 第22-24页 |
| ·PCR产物和中间载体的酶切 | 第24-26页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第24页 |
| ·酶切纯化的PCR产物和中间载体 | 第24-26页 |
| ·酶切产物的回收和纯化 | 第26-27页 |
| ·正向目的片段插入中间载体 | 第27-29页 |
| ·连接 | 第27页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第27-28页 |
| ·阳性重组菌落的PCR检测 | 第28-29页 |
| ·质粒提取 | 第29页 |
| ·酶切检测 | 第29页 |
| ·DNA测序鉴定 | 第29页 |
| ·反向目的片段插入含正向片段的中间载体 | 第29-30页 |
| ·RNAi载体构建 | 第30-34页 |
| ·P1基因150 bpRNAi载体构建 | 第30-31页 |
| ·CP基因100、404 bp和P1基因451 bp RNAi载体构建 | 第31-33页 |
| ·RNAi载体导入农杆菌 | 第33-34页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第33页 |
| ·RNAi载体导入农杆菌感受态细胞 | 第33页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第33-34页 |
| ·农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织 | 第34-37页 |
| ·玉米胚性愈伤组织的准备 | 第35-36页 |
| ·农杆菌浸染液的准备 | 第36页 |
| ·农杆菌浸染玉米胚性愈伤组织 | 第36页 |
| ·胚性愈伤组织的恢复培养 | 第36页 |
| ·胚性愈伤组织的筛选培养 | 第36页 |
| ·抗性愈伤组织的分化及植株再生 | 第36-37页 |
| ·再生植株的分子检测 | 第37-42页 |
| ·植物基因组DNA的提取 | 第37-38页 |
| ·再生植株目的基因PCR检测 | 第38-39页 |
| ·转基因T_1代株系基因组DNA Southern杂交检测 | 第39-42页 |
| ·杂交探针的制备 | 第39-40页 |
| ·转基因T_1代株系Southern杂交 | 第40-42页 |
| ·转基因植株田间抗病性鉴定 | 第42-43页 |
| ·田间试验设计 | 第42页 |
| ·鉴定方法 | 第42-43页 |
| ·转基因T_2代株系矮花叶病毒基因的表达量和蛋白积累量 | 第43-48页 |
| ·荧光定量PCR检测病毒基因表达量 | 第43-47页 |
| ·总RNA提取 | 第43-44页 |
| ·RNA反转录cDNA | 第44-45页 |
| ·荧光定量PCR | 第45-47页 |
| ·DAS-ELISA检测病毒蛋白积累量 | 第47-48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-81页 |
| ·RNAi植物表达载体构建 | 第48-60页 |
| ·CP基因100bp反向重复序列中间载体和表达载体 | 第48-51页 |
| ·含正向正向片段的中间载体 | 第48-49页 |
| ·含反向重复序列的中间载体 | 第49-50页 |
| ·含内含子的反向重复序列植物表达载体 | 第50-51页 |
| ·CP基因404bp反向重复序列中间载体和表达载体 | 第51-54页 |
| ·含正向片段的中间载体 | 第51-52页 |
| ·含反向片段的中间载体 | 第52-53页 |
| ·含内含子的反向重复序列的植物表达载体 | 第53-54页 |
| ·P1基因150bp反向重复序列中间载体和表达载体 | 第54-56页 |
| ·含正向片段的中间载体 | 第54-55页 |
| ·含反向片段的中间载体 | 第55页 |
| ·含内含子的反向重复序列植物表达载体 | 第55-56页 |
| ·P1基因451bp反向重复序列插入中间载体和表达载体 | 第56-60页 |
| ·含正向片段的中间载体 | 第56-58页 |
| ·含反向重复序列的中间载体 | 第58页 |
| ·含内含子的反向重复序列植物表达载体 | 第58-59页 |
| ·RNAi载体导入农杆菌 | 第59-60页 |
| ·农杆菌介导转化玉米转基因植株 | 第60-65页 |
| ·抗性愈伤组织 | 第60-61页 |
| ·抗性愈伤组织分化出再生植株 | 第61-63页 |
| ·烯效唑S3307和ABT生根粉对转基因再生植株的影响 | 第63-65页 |
| ·转基因再生植株的分子检测结果 | 第65-69页 |
| ·MDMV目的基因PCR检测 | 第65-68页 |
| ·Southern杂交结果 | 第68-69页 |
| ·转基因T_2代株系抗病性鉴定结果 | 第69-75页 |
| ·pASP150转基因T_2代株系抗病性鉴定 | 第69-71页 |
| ·pASC100、pASC404和pASP451转基因T_2代株系抗病性鉴定 | 第71-75页 |
| ·转基因株系中病毒基因表达量和病毒蛋白的积累量 | 第75-81页 |
| ·转基因T_2代株系荧光定量PCR检测结果 | 第75-79页 |
| ·RNA完整性检测 | 第75页 |
| ·外源CP和P1基因和18S内参基因的标准曲线 | 第75-77页 |
| ·转基因T_2代株系中病毒基因的表达量 | 第77-79页 |
| ·DAS-ELISA检测病毒蛋白积累量 | 第79-81页 |
| 4 讨论 | 第81-87页 |
| ·RNAi载体构建 | 第81-82页 |
| ·烯效唑S3307对胚性愈伤组织分化和成苗的作用 | 第82-83页 |
| ·转基因植株的抗病性 | 第83-87页 |
| ·反向重复序列目的基因片段长度对抗病性的影响 | 第84-85页 |
| ·外源基因拷贝数对抗病性的影响 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 攻读学位期间的相关学术论文及专利 | 第98页 |
