| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号及缩略词 | 第10-11页 |
| 中文部分 | 第11-76页 |
| 绪论 | 第11-13页 |
| 第一部分: 胆囊癌组织样本中差异miRNA的筛选和验证 | 第13-24页 |
| 1. 前言 | 第13页 |
| 2. 材料与方法 | 第13-17页 |
| 2.1 实验材料 | 第13-15页 |
| 2.1.1 人胆囊癌组织样本的收集和保存 | 第13-14页 |
| 2.1.2 Realtime-PCR试剂 | 第14-15页 |
| 2.1.3 主要实验仪器和设备 | 第15页 |
| 2.2 实验方法 | 第15-17页 |
| 2.2.1 人胆囊癌及其相对应正常组织样本的总RNA提取 | 第15-16页 |
| 2.2.2 实时荧光定量PCR法验证miRNA芯片结果 | 第16-17页 |
| 2.3 统计分析 | 第17页 |
| 3. 实验结果 | 第17-22页 |
| 3.1 胆囊癌组织中差异miRNA的筛选 | 第17-18页 |
| 3.2 TCGA数据库中miR-99a-5p表达情况分析 | 第18-19页 |
| 3.3 胆囊癌组织样本中miR-99a-5p的表达量 | 第19页 |
| 3.4 miR-99a-5p表达量与胆囊癌患者的临床病理资料和临床预后的相关性分析 | 第19-22页 |
| 4. 讨论 | 第22-23页 |
| 5. 小结 | 第23-24页 |
| 第二部分: miR-99a-5p在胆囊癌中的功能研究 | 第24-43页 |
| 1. 前言 | 第24-25页 |
| 2. 材料与方法 | 第25-34页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-28页 |
| 2.1.1 细胞 | 第25页 |
| 2.1.2 动物 | 第25页 |
| 2.1.3 主要实验所用试剂 | 第25-27页 |
| 2.1.4 仪器与设备 | 第27-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-34页 |
| 2.2.1 细胞培养 | 第28-29页 |
| 2.2.2 miR-99a-5p过表达与敲减试剂的合成与构建 | 第29页 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR方法检测细胞内miRNA表达量 | 第29页 |
| 2.2.4 细胞计数 | 第29页 |
| 2.2.5 Cell Counting Kit-8(CCK8)试验检测细胞体外增殖能力 | 第29-30页 |
| 2.2.6 克隆形成试验 | 第30-31页 |
| 2.2.7 细胞划痕愈合试验 | 第31页 |
| 2.2.8 Transwell小室迁移/侵袭试验 | 第31-32页 |
| 2.2.9 裸鼠皮下成瘤试验 | 第32页 |
| 2.2.10 裸鼠脾脏注射肝转移模型建立 | 第32-33页 |
| 2.2.11 蛋白印迹(Western Blot)试验 | 第33-34页 |
| 2.2.12 统计方法 | 第34页 |
| 3. 实验结果 | 第34-41页 |
| 3.1 miR-99a-5p对胆囊癌细胞增殖能力的影响 | 第34-37页 |
| 3.2 miR-99a-5p对胆囊癌细胞转移侵袭能力的影响 | 第37-41页 |
| 4. 讨论 | 第41-42页 |
| 5. 小结 | 第42-43页 |
| 第三部分: miR-99a-5p通过靶定MTOR和SMARCA5影响胆囊癌的功能 | 第43-58页 |
| 1. 前言 | 第43-44页 |
| 2. 材料与方法 | 第44-47页 |
| 2.1 实验材料 | 第44页 |
| 2.1.1 主要实验试剂 | 第44页 |
| 2.1.2 主要实验仪器 | 第44页 |
| 2.2 实验方法 | 第44-47页 |
| 2.2.1 通过生物信息学方法预测miR-99a-5p的靶基因 | 第44页 |
| 2.2.2 双荧光素酶报告基因实验 | 第44-45页 |
| 2.2.3 靶基因过表达质粒的构建与转染 | 第45-46页 |
| 2.2.4 小干扰RNA合成 | 第46-47页 |
| 2.2.5 主要实时定量荧光PCR引物列表 | 第47页 |
| 2.2.6 统计学分析 | 第47页 |
| 3. 实验结果 | 第47-56页 |
| 3.1 miR-99a-5p的靶基因预测 | 第47-48页 |
| 3.2 双荧光素酶报告基因试验验证miR-99a-5p的靶基因 | 第48-49页 |
| 3.3 miR-99a-5p对候选靶基因MTOR和SMARCA5表达量的影响 | 第49-50页 |
| 3.4 SMARCA5在胆囊癌患者组织中的表达以及与临床病例资料和预后的相关性 | 第50-52页 |
| 3.5 miR-99a-5p通过PI3K/AKT通路影响胆囊癌细胞的侵袭转移能力 | 第52-53页 |
| 3.6 SMARCA5对胆囊癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响 | 第53-55页 |
| 3.7 miR-99a-5p通过直接调控SMARCA5影响胆囊癌细胞的侵袭转移能力 | 第55-56页 |
| 4. 讨论 | 第56-57页 |
| 5. 小结 | 第57-58页 |
| 全文小结及展望 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 综述 | 第64-74页 |
| 参考文献 | 第70-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第75-76页 |
| 英语全文翻译 | 第76-130页 |
| Introduction | 第76-78页 |
| PART 1: Screening and validation of differential miRNAs ingallbladder cancer tissue samples | 第78-90页 |
| 1.Introduction | 第78-79页 |
| 2 Materials and Methods | 第79-82页 |
| 2.1 Materials | 第79-80页 |
| 2.1.1 Patients and specimens | 第79页 |
| 2.1.2 qRT-PCR reagents | 第79页 |
| 2.1.3 Main instruments and reagents | 第79-80页 |
| 2.2 Methods | 第80-82页 |
| 2.2.1 Total RNA extraction from GBC tissues and their corresponding peritumoraltissues | 第80-81页 |
| 2.2.2 Verifying the miRNA microarray result by qRT-PCR | 第81-82页 |
| 2.3 Statistical analysis | 第82页 |
| 3.Results | 第82-87页 |
| 3.1 Screening of differentially miRNAin GBC tissues | 第82-83页 |
| 3.2 miR-99a-5p expression analysis in TCGA database | 第83-84页 |
| 3.3 miR-99a-5p expression in GBC tissues | 第84-85页 |
| 3.4 Correlation analysis of miR-99a-5p expression with clinicopathologicalcharacteristics and prognosis in patients with GBC | 第85-87页 |
| 4.Discussion | 第87-88页 |
| 5.Conclusions | 第88-90页 |
| PART 2: Functional study of miR-99a-5p in GBC | 第90-109页 |
| 1.Introduction | 第90页 |
| 2.Materials and Methods | 第90-99页 |
| 2.1 Materials | 第90-94页 |
| 2.1.1 Cell lines | 第91页 |
| 2.2.2 Laboratory animals | 第91页 |
| 2.1.3 Main reagents | 第91-93页 |
| 2.1.4 Instruments and equipment | 第93-94页 |
| 2.2 Methods | 第94-99页 |
| 2.2.1 Cell culture | 第94页 |
| 2.2.2 Overexpression and knockout reagents9 synthesis and construction | 第94页 |
| 2.2.3 Detection of intracellular miRNA expression by qRT-PCR | 第94页 |
| 2.2.4 Cell counting | 第94-95页 |
| 2.2.5 Examination of cell proliferation in vitro by CCK8 assay | 第95页 |
| 2.2.6 Colony formation assay | 第95-96页 |
| 2.2.7 Wound healing assay | 第96-97页 |
| 2.2.8 Transwell cell migration/invasion assay | 第97-98页 |
| 2.2.9 Subcutaneous xenograft model of nude mice | 第98页 |
| 2.2.10 Splenic vein-liver metastasis tumor model of nude mice | 第98页 |
| 2.2.11 Western blot assay | 第98-99页 |
| 2.2.12 Statistical analysis | 第99页 |
| 3.Results | 第99-107页 |
| 3,1 Effects of miR-99a-5p on proliferation of GBC Cell lines | 第99-103页 |
| 3.2 Effects of miR_99a_5p on the invasion and metastasis of GBC cells | 第103-107页 |
| 4.Discussion | 第107-108页 |
| 5.Conclusion | 第108-109页 |
| PART 3: MiR-99a-5p affects the functions of GBC bytargeting MTOR and SMARCA5 | 第109-124页 |
| 1.Introduction | 第109-110页 |
| 2.Materials and Methods | 第110-113页 |
| 2.1 Materials | 第110页 |
| 2.2.1 Prediction of the target genes of miR-99a-5p by bioinformatics | 第110页 |
| 2.2.2 Dual luciferase reporter assay | 第110-111页 |
| 2.2.3 Construction and transfection of target genes overexpression plasmid | 第111-112页 |
| 2.2.4 Small interfering RNA synthesis | 第112页 |
| 2.2.5 Sequences of major qRT-PCR primers | 第112-113页 |
| 2.2.6 Statistical analysis | 第113-110页 |
| 2.2 Methods | 第110-113页 |
| 3.Results | 第113-121页 |
| 3.1 Prediction of target genes of miR-99a-5p | 第113-114页 |
| 3.2 Validation of target genes of miR-99a-5p by dual luciferase reporter assay | 第114-115页 |
| 3.3 Effects of miR-99a-5p on the expression of candidate target genes MTOR andSMARCA5 | 第115-116页 |
| 3.4 Expression of SMARCA5 in gallbladder carcinoma and its correlation withclinical data and prognosis | 第116-118页 |
| 3.5 MiR-99a-5p affected the invasion and metastasis of GBC cells by PI3K/AKTpathway | 第118页 |
| 3.6 Effects of SMARCA5 on proliferation，invasion and metastasis of GBC Cells | 第118-120页 |
| 3.7 MiR-99a-5p affected the invasion and metastasis of GBC cells by directregulating SMARCA5 | 第120-121页 |
| 4.Discussion | 第121-122页 |
| 5.Conclusion | 第122-124页 |
| Summary and prospect for this paper | 第124-125页 |
| Reference | 第125-130页 |
| 八年制学位论文要求 | 第130-132页 |
