| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-21页 |
| 1.1 禽流感病毒概述 | 第15页 |
| 1.2 流感病毒的形态和结构 | 第15-16页 |
| 1.3 HA蛋白 | 第16页 |
| 1.4 NA蛋白 | 第16页 |
| 1.5 NP蛋白 | 第16页 |
| 1.6 M1蛋白和M2蛋白 | 第16-17页 |
| 1.7 NS1蛋白和NS2蛋白 | 第17页 |
| 1.8 RNA聚合酶复合体 | 第17页 |
| 1.9 禽流感病毒的抗原变异 | 第17-18页 |
| 1.10 H7N9亚型流感病毒流行动态 | 第18页 |
| 1.11 抗原表位筛选方法 | 第18-19页 |
| 1.11.1 肽扫描技术 | 第19页 |
| 1.11.2 噬菌体展示技术 | 第19页 |
| 1.11.3 多肽芯片技术 | 第19页 |
| 1.12 免疫胶体金检测技术 | 第19-20页 |
| 1.12.1 胶体金的制备 | 第19-20页 |
| 1.12.2 免疫胶体金层析技术 | 第20页 |
| 1.12.3 禽流感病毒胶体金检测方法研究进展 | 第20页 |
| 1.13 研究目的和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 抗H7亚型流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备与生物学活性检测 | 第21-30页 |
| 2.1 材料方法 | 第21-25页 |
| 2.1.1 病毒、细胞和试验动物 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第22页 |
| 2.1.4 免疫原的纯化 | 第22页 |
| 2.1.5 动物免疫 | 第22页 |
| 2.1.6 MAb ELISA筛选方法最佳工作浓度的建立 | 第22-23页 |
| 2.1.7 骨髓瘤SP2/0 细胞的复苏 | 第23页 |
| 2.1.8 细胞融合 | 第23-24页 |
| 2.1.8.1 饲养层细胞的制备 | 第23页 |
| 2.1.8.2 免疫脾细胞的制备 | 第23页 |
| 2.1.8.3 细胞融合 | 第23页 |
| 2.1.8.4 阳性克隆的筛选及扩大培养 | 第23-24页 |
| 2.1.8.5 杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第24页 |
| 2.1.8.6 腹水的制备 | 第24页 |
| 2.1.9 单抗亚类鉴定 | 第24页 |
| 2.1.10 HI效价测定 | 第24页 |
| 2.1.11 ELISA效价测定 | 第24页 |
| 2.1.12 单抗特异性检测 | 第24-25页 |
| 2.1.13 单抗稳定性的检测 | 第25页 |
| 2.2 结果 | 第25-29页 |
| 2.2.1 免疫原纯化后HA效价和浓度 | 第25页 |
| 2.2.2 ELISA筛选方法最佳工作浓度的建立 | 第25页 |
| 2.2.3 亚类鉴定 | 第25-26页 |
| 2.2.4 HI效价测定 | 第26-27页 |
| 2.2.5 ELISA效价测定 | 第27-28页 |
| 2.2.6 单抗特异性检测 | 第28-29页 |
| 2.2.7 单抗的稳定性 | 第29页 |
| 2.3 讨论 | 第29-30页 |
| 第三章 H7N9流感病毒HA蛋白抗原表位的鉴定与分析 | 第30-43页 |
| 3.1 材料与方法 | 第30-36页 |
| 3.1.1 主要载体 | 第30页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第30页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第30页 |
| 3.1.4 原核重组质粒的构建及蛋白诱导表达 | 第30-32页 |
| 3.1.4.1 引物设计 | 第30-31页 |
| 3.1.4.2 目的基因的扩增 | 第31页 |
| 3.1.4.3 目的基因与克隆载体双酶切 | 第31-32页 |
| 3.1.4.4 连接 | 第32页 |
| 3.1.4.5 转化 | 第32页 |
| 3.1.4.6 阳性克隆鉴定及测序 | 第32页 |
| 3.1.4.7 蛋白诱导表达 | 第32页 |
| 3.1.5 Western blotting筛选抗原表位 | 第32-33页 |
| 3.1.6 单抗的腹水纯化 | 第33页 |
| 3.1.7 噬菌体展示技术筛选抗原表位 | 第33-34页 |
| 3.1.7.1 肽库的生物淘选 | 第33页 |
| 3.1.7.2 噬菌体的扩增 | 第33-34页 |
| 3.1.7.3 测定噬菌体滴度 | 第34页 |
| 3.1.7.4 噬菌斑的扩增及纯化 | 第34页 |
| 3.1.8 利用多肽芯片筛选抗原表位 | 第34页 |
| 3.1.9 真核重组质粒的构建及蛋白诱导表达 | 第34-36页 |
| 3.1.9.1 引物设计 | 第34-35页 |
| 3.1.9.2 目的基因扩增 | 第35页 |
| 3.1.9.3 克隆载体的酶切 | 第35页 |
| 3.1.9.4 同源重组 | 第35页 |
| 3.1.9.5 转化 | 第35页 |
| 3.1.9.6 阳性克隆鉴定及测序 | 第35页 |
| 3.1.9.7 重组质粒提取 | 第35-36页 |
| 3.1.9.8 蛋白表达 | 第36页 |
| 3.1.10 间接免疫荧光试验 | 第36页 |
| 3.2 结果 | 第36-41页 |
| 3.2.1 原核重组质粒的构建与蛋白诱导表达 | 第36页 |
| 3.2.2 肽扫描技术筛选抗原表位 | 第36-37页 |
| 3.2.3 单抗纯化结果 | 第37页 |
| 3.2.4 淘选过程中噬菌体回收率 | 第37-38页 |
| 3.2.5 利用单抗筛选出的噬菌体序列及分析 | 第38-39页 |
| 3.2.6 利用多肽芯片筛选抗原表位 | 第39-40页 |
| 3.2.7 H7N9毒株HA基因的PCR扩增和序列分析 | 第40页 |
| 3.2.8 重组质粒的菌液鉴定 | 第40页 |
| 3.2.9 真核蛋白诱导表达 | 第40-41页 |
| 3.2.10 间接免疫荧光试验 | 第41页 |
| 3.3 讨论 | 第41-43页 |
| 第四章 H7亚型禽流感胶体金试纸条的研制 | 第43-53页 |
| 4.1 材料方法 | 第43-46页 |
| 4.1.1 毒株和抗体 | 第43页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第43页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第43页 |
| 4.1.4 主要溶液和样品准备 | 第43-44页 |
| 4.1.5 胶体金试纸条最适条件的确定 | 第44-45页 |
| 4.1.5.1 最佳标记pH值的选择 | 第44页 |
| 4.1.5.2 胶体金蛋白最佳标记量的选择 | 第44页 |
| 4.1.5.3 制备胶体金标记蛋白 | 第44页 |
| 4.1.5.4 检测线包被抗体浓度和质控线包被抗体浓度的选择 | 第44-45页 |
| 4.1.5.5 最佳硝酸纤维素膜的选择 | 第45页 |
| 4.1.5.6 最佳膜烘干时间的选择 | 第45页 |
| 4.1.5.7 最佳观察时间的选择 | 第45页 |
| 4.1.6 胶体金试纸条的制备 | 第45页 |
| 4.1.7 胶体金试纸条结果的判定 | 第45-46页 |
| 4.1.8 胶体金试纸条特异性试验 | 第46页 |
| 4.1.9 胶体金免疫层析试纸条广谱性试验 | 第46页 |
| 4.1.10 胶体金试纸条敏感性试验 | 第46页 |
| 4.1.11 胶体金免疫层析试纸条稳定性试验 | 第46页 |
| 4.1.12 胶体金免疫层析试纸条重复性试验 | 第46页 |
| 4.2 结果 | 第46-52页 |
| 4.2.1 最佳标记pH值的确定 | 第46-47页 |
| 4.2.2 最佳蛋白标记量的确定 | 第47页 |
| 4.2.3 检测线抗体浓度和质控线二抗浓度的确定 | 第47-48页 |
| 4.2.4 硝酸纤维素膜的确定 | 第48-49页 |
| 4.2.5 膜烘干工艺的确定 | 第49页 |
| 4.2.6 观察时间的确定 | 第49-50页 |
| 4.2.7 胶体金免疫层析试纸条的特异性 | 第50页 |
| 4.2.8 胶体金免疫层析试纸条的广谱性 | 第50-51页 |
| 4.2.9 胶体金免疫层析试纸条的敏感性 | 第51页 |
| 4.2.10 胶体金免疫层析试纸条的稳定性 | 第51页 |
| 4.2.11 胶体金免疫层析试纸条的重复性 | 第51-52页 |
| 4.3 讨论 | 第52-53页 |
| 第五章 全文结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 作者简历 | 第60页 |
