| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 目录 | 第9-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-18页 |
| 1.1 基孔肯雅热简介 | 第14-16页 |
| 1.1.1 CHIKV 流行病学 | 第14-15页 |
| 1.1.2 CHIKV 病原学 | 第15-16页 |
| 1.4 | 第16-18页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 基孔肯雅热病毒 E2 蛋白的表达与纯化 | 第18-46页 |
| 2.1 引言 | 第18页 |
| 2.2 实验材料 | 第18-23页 |
| 2.2.1 菌种，基因，质粒及引物 | 第18-19页 |
| 2.2.2 仪器设备 | 第19-20页 |
| 2.2.3 主要试剂 | 第20-21页 |
| 2.2.4 培养基及常用溶液的配制 | 第21-23页 |
| 2.2.4.1 培养基的配制 | 第21页 |
| 2.2.4.2 SDS-PAGE 常用液 | 第21-22页 |
| 2.2.4.3 蛋白纯化工作液 | 第22页 |
| 2.2.4.4 Western blot 常用溶液 | 第22-23页 |
| 2.2.4.5 包涵体变复性工作液 | 第23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-35页 |
| 2.3.1 E1 基因的获得及基因型分析 | 第23-25页 |
| 2.3.1.1 引物设计 | 第23页 |
| 2.3.1.2 病毒总 RNA 的提取 | 第23-24页 |
| 2.3.1.3 RT-PCR 扩增 | 第24-25页 |
| 2.3.1.4 E1 基因序列测序及病毒基因型分析 | 第25页 |
| 2.3.2 pET22b-E2 表达载体的构建及鉴定 | 第25-31页 |
| 2.3.2.1 E2 基因的获得 | 第25-26页 |
| 2.3.2.2 E2 PCR 扩增产物连接 PMD18-T 载体 | 第26页 |
| 2.3.2.3 感受态细胞的制备 | 第26-27页 |
| 2.3.2.4 连接产物转化 E.coli DH5α | 第27-28页 |
| 2.3.2.5 PMD18-T-E2 质粒的提取及测序 | 第28页 |
| 2.3.2.6 PMD18-T-E2 和 pET22b 载体的双酶切和连接 | 第28-29页 |
| 2.3.2.7 连接产物转化 E.coli DH5α | 第29-30页 |
| 2.3.2.8 pET22b-E2 重组质粒的鉴定 | 第30-31页 |
| 2.3.3 重组质粒转化 E.coli BL21(DE3)及阳性克隆的获得 | 第31页 |
| 2.3.4 小量诱导表达 | 第31-32页 |
| 2.3.5 Western blot 鉴定 | 第32-33页 |
| 2.3.6 大量表达 | 第33-34页 |
| 2.3.7 包涵体洗涤和变性 | 第34页 |
| 2.3.8 Ni 柱亲和层析 | 第34页 |
| 2.3.9 蛋白复性 | 第34-35页 |
| 2.4 实验结果 | 第35-45页 |
| 2.4.1 E1 基因 RT-PCR 扩增结果 | 第35页 |
| 2.4.2 E1 基因序列测序及病毒基因型分析结果 | 第35-36页 |
| 2.4.3 E2 基因 RT-PCR 扩增结果 | 第36-37页 |
| 2.4.4 E2-TA 克隆质粒菌落 PCR 结果 | 第37页 |
| 2.4.5 E2-TA 克隆质粒双酶切及测序结果 | 第37-38页 |
| 2.4.6 pET22b-E2 重组质粒的鉴定结果 | 第38-39页 |
| 2.4.6.1 菌落 PCR 鉴定结果 | 第38页 |
| 2.4.6.2 双酶切鉴定结果 | 第38-39页 |
| 2.4.7 小量诱导表达及诱导条件优化 | 第39-42页 |
| 2.4.7.1 初步的小量表达及 western blot 鉴定 | 第39-40页 |
| 2.4.7.2 诱导温度优化 | 第40-41页 |
| 2.4.7.3 IPTG 诱导浓度的优化 | 第41-42页 |
| 2.4.8 蛋白纯化及 western blot 鉴定结果 | 第42-43页 |
| 2.4.9 蛋白复性及 western blot 鉴定结果 | 第43-45页 |
| 2.5 本章小结 | 第45-46页 |
| 第三章 E2 单克隆抗体的制备及 ELISA 平台检测方法的建立 | 第46-72页 |
| 3.1 引言 | 第46页 |
| 3.2 实验材料 | 第46-49页 |
| 3.2.1 实验动物与细胞株 | 第46页 |
| 3.2.2 主要仪器设备、耗材 | 第46-47页 |
| 3.2.3 主要试剂 | 第47-48页 |
| 3.2.4 培养基与常用溶液 | 第48-49页 |
| 3.2.4.1 单克隆抗体制备 | 第48页 |
| 3.2.4.2 ELISA 常用溶液 | 第48-49页 |
| 3.2.4.3 单克隆抗体的纯化常用溶液 | 第49页 |
| 3.2.4.4 HRP 标记抗体常用溶液 | 第49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-58页 |
| 3.3.1 单克隆抗体的制备 | 第49-55页 |
| 3.3.1.1 Balb/c 小鼠的免疫 | 第49-50页 |
| 3.3.1.2 间接 ELISA 检测 | 第50-51页 |
| 3.3.1.3 细胞融合 | 第51-52页 |
| 3.3.1.4 阳性克隆的筛选 | 第52-53页 |
| 3.3.1.5 杂交瘤细胞的亚克隆及扩大培养 | 第53-54页 |
| 3.3.1.6 腹水的制备及抗体的纯化 | 第54-55页 |
| 3.3.2 单克隆抗体的鉴定评价 | 第55-56页 |
| 3.3.2.1 单克隆抗体亚型的鉴定 | 第55页 |
| 3.3.2.2 腹水及纯化后抗体效价的测定 | 第55-56页 |
| 3.3.2.3 SDS-PAGE 检测纯化抗体 | 第56页 |
| 3.3.2.4 细胞株及相应抗体稳定性检测 | 第56页 |
| 3.3.3 ELISA 平台双抗体夹心法检测 E2 方法的建立 | 第56-58页 |
| 3.3.3.1 HRP 标记方法 | 第56-57页 |
| 3.3.3.2 HRP 标记抗体 ELISA 工作浓度确定 | 第57页 |
| 3.3.3.3 抗体在 ELISA 平台的配对 | 第57-58页 |
| 3.3.3.4 抗体对 ELISA 平台灵敏度比较 | 第58页 |
| 3.3.3.5 抗体对工作浓度优化 | 第58页 |
| 3.3.3.6 双抗体夹心法检测不同浓度抗原 | 第58页 |
| 3.4 实验结果 | 第58-70页 |
| 3.4.1 单克隆抗体的制备和评价 | 第58-64页 |
| 3.4.1.1 小鼠血清的效价分析 | 第58-59页 |
| 3.4.1.2 阳性杂交瘤的筛选 | 第59-61页 |
| 3.4.1.3 腹水及纯化后抗体效价检测 | 第61-62页 |
| 3.4.1.4 SDS-PAGE 检测纯化后的抗体 | 第62-63页 |
| 3.4.1.5 单克隆抗体亚类的鉴定 | 第63页 |
| 3.4.1.6 杂交瘤细胞株的稳定性及相应抗体的稳定性 | 第63-64页 |
| 3.4.2 ELISA 平台双抗体夹心法检测 E2 方法的建立 | 第64-70页 |
| 3.4.2.1 单克隆抗体 HRP 标记结果分析 | 第64-65页 |
| 3.4.2.2 HRP 标记抗体 ELISA 工作浓度确定 | 第65-66页 |
| 3.4.2.3 抗体在 ELISA 平台的配对 | 第66-67页 |
| 3.4.2.4 抗体对 ELISA 平台灵敏度比较 | 第67-68页 |
| 3.4.2.5 抗体对工作浓度优化 | 第68-69页 |
| 3.4.2.6 双抗体夹心法检测不同浓度抗原 | 第69-70页 |
| 3.5 本章小结 | 第70-72页 |
| 结论和展望 | 第72-74页 |
| 1. 结论 | 第72页 |
| 2. 创新点 | 第72-73页 |
| 3. 展望 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 附件 | 第85页 |
