| 中文摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 英文缩略词表 | 第11-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-33页 |
| 1 副猪嗜血杆菌研究概况 | 第19-24页 |
| 1.1 副猪嗜血杆菌的感染致病机制研究 | 第19-21页 |
| 1.1.1 副猪嗜血杆菌具有IgA蛋白酶活性而逃避粘膜免疫 | 第19-20页 |
| 1.1.2 副猪嗜血杆菌能够抵御肺部的天然免疫反应 | 第20页 |
| 1.1.3 副猪嗜血杆菌可以抵抗血清补体的杀菌作用 | 第20页 |
| 1.1.4 副猪嗜血杆菌可以粘附和侵入宿主细胞 | 第20-21页 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌致病性相关毒力因子 | 第21-24页 |
| 1.2.1 荚膜capsule | 第21页 |
| 1.2.2 脂寡糖LOS | 第21-22页 |
| 1.2.3 外膜孔蛋白OMP | 第22页 |
| 1.2.4 蛋白酶类 | 第22-23页 |
| 1.2.5 细胞致死膨胀毒素CDT | 第23-24页 |
| 1.2.6 三聚体自转运蛋白VtaA | 第24页 |
| 1.2.7 转铁结合蛋白Tbp | 第24页 |
| 2 大黄素的抗菌作用及机制研究 | 第24-26页 |
| 2.1 大黄素抗菌活性研究 | 第25页 |
| 2.2 大黄素抗菌作用机制研究 | 第25-26页 |
| 3 蛋白质组学及其在药物研究中的应用概况 | 第26-32页 |
| 3.1 蛋白质组学研究的主要技术 | 第26-30页 |
| 3.1.1 双向凝胶电泳2-DE | 第27页 |
| 3.1.2 荧光差异双向电泳2D-DIGE | 第27页 |
| 3.1.3 非标记定量技术Label free | 第27-28页 |
| 3.1.4 同位素标记亲和标签技术iCAT | 第28页 |
| 3.1.5 同位素标记相对和绝对定量技术iTRAQ | 第28-30页 |
| 3.2 蛋白质组学在药物研发中的应用 | 第30-32页 |
| 3.2.1 药物靶点的探测与确认 | 第30-31页 |
| 3.2.2 阐明药物作用机制 | 第31页 |
| 3.2.3 药物毒理作用及安全性评价 | 第31-32页 |
| 3.2.4 研究耐药相关机制 | 第32页 |
| 4 研究目的及意义 | 第32-33页 |
| 第二章 大黄素对副猪嗜血杆菌的体外抗菌特性研究 | 第33-42页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第33-35页 |
| 1.1 实验药物 | 第33页 |
| 1.2 实验菌株 | 第33页 |
| 1.3 主要试剂 | 第33-34页 |
| 1.4 细菌培养基的配制 | 第34页 |
| 1.5 SDS-PAGE电泳相关溶液的配制 | 第34页 |
| 1.6 实验仪器 | 第34-35页 |
| 2 实验方法 | 第35-36页 |
| 2.1 大黄素抗菌活性评价 | 第35-36页 |
| 2.1.1 药液的制备 | 第35页 |
| 2.1.2 细菌菌悬液的制备 | 第35页 |
| 2.1.3 DMSO对副猪嗜血杆菌生长影响的测定 | 第35页 |
| 2.1.4 MIC和MBC的测定 | 第35-36页 |
| 2.2 大黄素对副猪嗜血杆菌生长曲线的测定 | 第36页 |
| 2.3 大黄素作用副猪嗜血杆菌的SDS-PAGE分析 | 第36页 |
| 3 实验结果 | 第36-38页 |
| 3.1 大黄素抗菌活性评价 | 第36-37页 |
| 3.2 大黄素对副猪嗜血杆菌生长曲线的影响 | 第37-38页 |
| 3.3 大黄素作用副猪嗜血杆菌的SDS-PAGE分析 | 第38页 |
| 4 讨论 | 第38-41页 |
| 4.1 DMSO作为供试药物溶媒在药物干预细胞实验中的应用 | 第38-39页 |
| 4.2 药物体外抗菌活性评价方法 | 第39页 |
| 4.3 大黄素对副猪嗜血杆菌的抗菌活性 | 第39-40页 |
| 4.4 大黄素对副猪嗜血杆菌菌体总蛋白表达的影响 | 第40-41页 |
| 5 小结 | 第41-42页 |
| 第三章 基于iTRAQ技术大黄素作用下副猪嗜血杆菌的蛋白质组学分析 | 第42-68页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第42-43页 |
| 1.1 实验药物 | 第42页 |
| 1.2 实验菌株 | 第42页 |
| 1.3 主要试剂 | 第42-43页 |
| 1.4 细菌培养基的配制 | 第43页 |
| 1.5 蛋白提取及检测相关溶液的配制 | 第43页 |
| 1.6 实验仪器 | 第43页 |
| 2 实验方法 | 第43-49页 |
| 2.1 菌体制备 | 第44页 |
| 2.2 蛋白样品制备 | 第44页 |
| 2.3 SDS-PAGE电泳 | 第44-45页 |
| 2.4 酶解和肽段定量 | 第45页 |
| 2.5 肽段标记 | 第45页 |
| 2.6 混合肽段的SCX组分分级与脱盐 | 第45-46页 |
| 2.7 毛细管高效液相色谱 | 第46页 |
| 2.8 质谱鉴定 | 第46-47页 |
| 2.9 质谱数据分析 | 第47-48页 |
| 2.10 蛋白组生物信息学分析 | 第48-49页 |
| 2.10.1 蛋白质鉴定信息分析 | 第48页 |
| 2.10.2 Gene Ontology (GO)功能注释 | 第48页 |
| 2.10.3 差异蛋白的GO富集分析 | 第48页 |
| 2.10.4 差异蛋白KEGG pathway通路注释 | 第48页 |
| 2.10.5 差异蛋白pathway富集分析 | 第48-49页 |
| 3 实验结果 | 第49-62页 |
| 3.1 蛋白质浓度检测 | 第49-50页 |
| 3.2 蛋白质鉴定和定量结果评估 | 第50-54页 |
| 3.2.1 肽段离子得分分布 | 第50页 |
| 3.2.2 基本鉴定信息 | 第50-51页 |
| 3.2.3 肽段序列长度分布 | 第51页 |
| 3.2.4 肽段序列覆盖度 | 第51-52页 |
| 3.2.5 肽段数量分布 | 第52页 |
| 3.2.6 蛋白质相对分子质量分布 | 第52-53页 |
| 3.2.7 蛋白质等电点分布 | 第53-54页 |
| 3.3 蛋白质GO功能注释 | 第54-56页 |
| 3.4 差异表达蛋白分析 | 第56-62页 |
| 3.4.1 差异蛋白定量结果统计 | 第56页 |
| 3.4.2 差异蛋白GO注释 | 第56-59页 |
| 3.4.3 差异蛋白GO富集分析 | 第59-61页 |
| 3.4.4 差异蛋白pathway富集分析 | 第61-62页 |
| 4 讨论 | 第62-67页 |
| 4.1 iTRAQ技术在药物抗菌机制中的应用 | 第62-63页 |
| 4.2 大黄素作用下副猪嗜血杆菌差异蛋白分析 | 第63-66页 |
| 4.2.1 细菌代谢相关蛋白 | 第64页 |
| 4.2.2 细菌核糖体相关蛋白 | 第64-65页 |
| 4.2.3 细菌细胞分裂相关蛋白 | 第65-66页 |
| 4.2.4 细菌毒力因子相关蛋白 | 第66页 |
| 4.3 大黄素作用副猪嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌的蛋白质变化异同分析 | 第66-67页 |
| 5 小结 | 第67-68页 |
| 第四章 大黄素对差异毒力因子基因转录的调节作用研究 | 第68-81页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第68-69页 |
| 1.1 实验药物 | 第68页 |
| 1.2 实验菌株 | 第68页 |
| 1.3 主要试剂 | 第68页 |
| 1.4 细菌培养基的配制 | 第68页 |
| 1.5 主要实验仪器 | 第68-69页 |
| 2 实验方法 | 第69-72页 |
| 2.1 供试药物的制备 | 第69页 |
| 2.2 引物设计 | 第69页 |
| 2.3 细菌总RNA的提取及反转录 | 第69-71页 |
| 2.4 PCR产物回收纯化 | 第71页 |
| 2.5 退火温度的筛选 | 第71-72页 |
| 2.6 标准曲线及扩增效率的检测 | 第72页 |
| 2.7 大黄素对副猪嗜血杆菌差异毒力因子基因转录的影响检测 | 第72页 |
| 3 实验结果 | 第72-78页 |
| 3.1 RNA完整性和纯度分析 | 第72-73页 |
| 3.2 引物特异性检测 | 第73页 |
| 3.3 引物退火温度 | 第73-77页 |
| 3.4 标准曲线及扩增效率 | 第77页 |
| 3.5 大黄素对差异毒力因子基因转录的影响检测结果 | 第77-78页 |
| 4 讨论 | 第78-80页 |
| 4.1 相对定量RT-PCR的应用 | 第78-79页 |
| 4.2 大黄素对副猪嗜血杆菌差异毒力因子基因转录的影响 | 第79-80页 |
| 5 小结 | 第80-81页 |
| 第五章 大黄素对差异毒力因子相关功能的影响研究 | 第81-97页 |
| 1 实验材料与仪器 | 第81-83页 |
| 1.1 实验药物 | 第81页 |
| 1.2 实验菌株和细胞 | 第81页 |
| 1.3 主要试剂 | 第81-82页 |
| 1.4 细菌培养基的配制 | 第82页 |
| 1.5 细胞培养液的配制 | 第82页 |
| 1.6 主要实验仪器 | 第82-83页 |
| 2 实验方法 | 第83-86页 |
| 2.1 供试药物的制备 | 第83页 |
| 2.2 猪肺泡巨噬细胞PAM的分离 | 第83页 |
| 2.3 DMSO对细胞生长的影响测定 | 第83页 |
| 2.4 大黄素的细胞毒性测定 | 第83-84页 |
| 2.5 副猪嗜血杆菌活菌数与OD_(600)相关性曲线的建立 | 第84页 |
| 2.6 大黄素对副猪嗜血杆菌粘附pk-15细胞的抑制作用检测 | 第84-85页 |
| 2.7 大黄素对副猪嗜血杆菌入侵pk-15细胞的抑制作用检测 | 第85页 |
| 2.8 大黄素对副猪嗜血杆菌抗PAM吞噬作用的检测 | 第85页 |
| 2.9 大黄素对副猪嗜血杆菌抗血清补体杀灭作用的检测 | 第85-86页 |
| 2.10 大黄素对副猪嗜血杆菌诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的影响检测 | 第86页 |
| 2.10.1 副猪嗜血杆菌诱导炎症因子的模型建立 | 第86页 |
| 2.10.2 大黄素对副猪嗜血杆菌诱导炎症因子产生的影响 | 第86页 |
| 3 实验结果 | 第86-93页 |
| 3.1 PAM的形态学观察 | 第86-87页 |
| 3.2 大黄素的细胞毒性结果 | 第87页 |
| 3.3 副猪嗜血杆菌活菌数与OD_(600)的相关性曲线 | 第87-88页 |
| 3.4 大黄素对副猪嗜血杆菌粘附PK-15细胞的抑制作用 | 第88-89页 |
| 3.5 大黄素对副猪嗜血杆菌入侵PK-15细胞的抑制作用 | 第89-90页 |
| 3.6 大黄素对副猪嗜血杆菌抗PAM吞噬作用的影响 | 第90-91页 |
| 3.7 大黄素对副猪嗜血杆菌抗血清补体杀灭作用的影响 | 第91页 |
| 3.8 大黄素对副猪嗜血杆菌诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的影响 | 第91-93页 |
| 3.8.1 副猪嗜血杆菌诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的模型建立 | 第91-92页 |
| 3.8.2 大黄素对副猪嗜血杆菌诱导炎症因子产生的影响 | 第92-93页 |
| 4 讨论 | 第93-96页 |
| 4.1 大黄素的细胞毒性评价 | 第93-94页 |
| 4.2 大黄素对副猪嗜血杆菌粘附侵袭细胞以及抗吞噬能力的影响 | 第94页 |
| 4.3 大黄素对副猪嗜血杆菌抵抗血清补体杀灭作用的影响 | 第94-95页 |
| 4.4 大黄素对副猪嗜血杆菌诱导炎症因子产生水平的影响 | 第95-96页 |
| 5 小结 | 第96-97页 |
| 第六章 结论与创新 | 第97-98页 |
| 1 结论 | 第97页 |
| 2 创新性 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 附表 | 第112-113页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 | 第113页 |
