| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第1章 引言 | 第11-16页 |
| 1.1 高通量测序 | 第11-12页 |
| 1.2 单细胞高通量测序 | 第12-16页 |
| 1.2.1 单细胞分离技术 | 第12-13页 |
| 1.2.2 单细胞基因组高通量测序 | 第13-14页 |
| 1.2.3 单细胞外显子组高通量测序 | 第14页 |
| 1.2.4 单细胞转录组高通量测序 | 第14-16页 |
| 第2章 材料与方法 | 第16-19页 |
| 2.1 仪器和设备 | 第16-17页 |
| 2.2 试剂及耗材 | 第17-18页 |
| 2.3 实验所用的引物序列 | 第18-19页 |
| 第3章 实验方法 | 第19-50页 |
| 3.1 实验技术路线 | 第19页 |
| 3.2 二细胞期细胞转录组文库构建 | 第19-22页 |
| 3.2.1 单细胞裂解 | 第19页 |
| 3.2.2 cDNA第一链合成 | 第19页 |
| 3.2.3 游离引物的去除 | 第19页 |
| 3.2.4 3’-Poly-A加尾 | 第19-20页 |
| 3.2.5 cDNA的第二链合成 | 第20页 |
| 3.2.6 PCR预扩增 | 第20页 |
| 3.2.7 GAPDH定量分析,确定cDNA文库的预扩增质量 | 第20-21页 |
| 3.2.8 PCR预扩增产物的纯化 | 第21页 |
| 3.2.9 二轮PCR扩增 | 第21-22页 |
| 3.2.10 二轮PCR产物纯化 | 第22页 |
| 3.3 引物二聚体的去除 | 第22-23页 |
| 3.4 SOLiD文库构建 | 第23-36页 |
| 3.4.1 cDNA片段化 | 第24页 |
| 3.4.2 DNA片段末端补平 | 第24-25页 |
| 3.4.3 DNA片段的纯化 | 第25页 |
| 3.4.4 DNA片段两端加接头 | 第25页 |
| 3.4.5 含接头DNA片段的纯化 | 第25-26页 |
| 3.4.6 文库扩增 | 第26-27页 |
| 3.4.7 文库扩增产物的纯化 | 第27页 |
| 3.4.8 割胶回收 | 第27-28页 |
| 3.4.9 油包水PCR | 第28-31页 |
| 3.4.9.1 准备油相 | 第28页 |
| 3.4.9.2 准备水相 | 第28-29页 |
| 3.4.9.3 P1 DNA Beads的准备 | 第29页 |
| 3.4.9.4 油包水的建立 | 第29-31页 |
| 3.4.10 P1 beads的洗涤 | 第31-32页 |
| 3.4.10.1 油包水的破除 | 第31-32页 |
| 3.4.10.2 含模板P1 DNA beads的洗涤 | 第32页 |
| 3.4.11 模板P1 DNAbeads的富集 | 第32-35页 |
| 3.4.11.1 配制变性缓冲液 | 第32页 |
| 3.4.11.2 配制60%甘油 | 第32-33页 |
| 3.4.11.3 P2 beads的准备 | 第33页 |
| 3.4.11.4 待富集P1 DNA beads的准备 | 第33页 |
| 3.4.11.5 模板P1 DNA beads的富集 | 第33-34页 |
| 3.4.11.6 P2 beads的去除 | 第34-35页 |
| 3.4.12 3 ’末端修饰 | 第35-36页 |
| 3.5 Workflow Analysis(WFA)分析 | 第36-46页 |
| 3.5.1 富集的P1 beads的洗涤 | 第36页 |
| 3.5.2 WFA beads的固定 | 第36-37页 |
| 3.5.3 WFA试剂的准备与安装 | 第37-41页 |
| 3.5.3.1 WFA试剂的准备 | 第37页 |
| 3.5.3.2 WFA试剂的安装 | 第37-40页 |
| 3.5.3.3 WFA strip的安装 | 第40-41页 |
| 3.5.4 WFA slide的安装 | 第41-43页 |
| 3.5.4.1 WFA slide的准备 | 第41页 |
| 3.5.4.2 WFA slide的安装 | 第41-43页 |
| 3.5.5 WFA程序的创建 | 第43-44页 |
| 3.5.6 聚焦 | 第44-46页 |
| 3.5.7 运行WFA程序 | 第46页 |
| 3.5.8 监控WFA的进程 | 第46页 |
| 3.6 样品测序分析 | 第46-49页 |
| 3.6.1 测序beads的洗涤 | 第46页 |
| 3.6.2 测序beads的固定 | 第46页 |
| 3.6.3 测序试剂的准备与安装 | 第46-47页 |
| 3.6.3.1 测序试剂的准备 | 第46-47页 |
| 3.6.3.2 测序试剂的安装 | 第47页 |
| 3.6.3.3 测序strips的安装 | 第47页 |
| 3.6.4 测序slide的安装 | 第47页 |
| 3.6.4.1 测序slide的准备 | 第47页 |
| 3.6.4.2 测序slide的安装 | 第47页 |
| 3.6.5 测序程序的创建 | 第47-49页 |
| 3.6.6 聚焦 | 第49页 |
| 3.6.7 运行测序程序 | 第49页 |
| 3.6.8 监控测序的进程 | 第49页 |
| 3.7 生物信息学数据分析 | 第49-50页 |
| 3.7.1 读段映射到基因组 | 第49页 |
| 3.7.2 基因表达量的计算 | 第49页 |
| 3.7.3 GO分析 | 第49-50页 |
| 第4章 结果与分析 | 第50-60页 |
| 4.1 预扩增PCR产物的分析 | 第50页 |
| 4.2 预扩增PCR产物纯化后浓度的测定 | 第50-51页 |
| 4.3 引物去除及样品回收结果 | 第51页 |
| 4.4 WFA结果 | 第51-52页 |
| 4.5 测序质量分析 | 第52-55页 |
| 4.5.1 读段的映射情况 | 第52-53页 |
| 4.5.2 读段质量分析 | 第53-55页 |
| 4.6 检测到基因的情况 | 第55页 |
| 4.7 相关性的分析 | 第55-56页 |
| 4.8 差异性的分析 | 第56-58页 |
| 4.9 GO分析结果 | 第58-60页 |
| 第5章 讨论 | 第60-64页 |
| 5.1 单细胞转录组分析的特点 | 第61-62页 |
| 5.2 细胞胚胎的极性研究 | 第62-63页 |
| 5.3 二单细胞转录组测序研究的展望 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-67页 |
