| ACKNOWLEDGEMTS | 第6-15页 |
| INTRODUCTION | 第15-24页 |
| ABSTRACT | 第24-29页 |
| 中文摘要 | 第30-37页 |
| ABBREVIATIONS | 第37-39页 |
| PARTⅠFunctional expression and purification system of PD-L1 extracellular domain byusing Escherichia coli host cell machinery | 第39-57页 |
| 1.1. Background | 第39-42页 |
| 1.2. Materials and Methods | 第42-47页 |
| 1.2.1 Bacterial strains and vectors | 第42页 |
| 1.2.2 Plasmid extraction and gel electrophoresis | 第42-43页 |
| 1.2.3 Primer design and amplification of PDL1-ECD | 第43-44页 |
| 1.2.4 Cloning and expression of PDL1-ECD | 第44-45页 |
| 1.2.5 Purification of recombinant PDL1-ECD | 第45-46页 |
| 1.2.6 Refolding of recombinant PDL1-ECD | 第46页 |
| 1.2.7 Western blot analysis | 第46页 |
| 1.2.8 Statistical analysis | 第46-47页 |
| 1.3. Results | 第47-54页 |
| 1.3.1. PCR amplification and cloning of PDL1-ECD | 第47-48页 |
| 1.3.2. Expression of recombinant proteins | 第48-51页 |
| 1.3.3. Purification, dialysis and antigenic analysis of recombinant proteins | 第51-54页 |
| 1.4. Discussion | 第54-56页 |
| 1.5. Conclusions | 第56-57页 |
| PARTⅡ Systematic development and bioactive confirmation of single chain fragment(scFv) against PD-L1 | 第57-82页 |
| 2.1 Background | 第57-60页 |
| 2.2 Methodology | 第60-69页 |
| 2.2.1 Cell lines and reagents | 第60页 |
| 2.2.2 Helper phage enrichment | 第60-61页 |
| 2.2.3 Library amplification | 第61页 |
| 2.2.4 Biopanning | 第61-62页 |
| 2.2.5 Screening of positive clones | 第62-63页 |
| 2.2.6 Phage ELISA | 第63页 |
| 2.2.7 Positive phage enrichment | 第63-64页 |
| 2.2.8 Construction of recombinant vector | 第64-65页 |
| 2.2.9 Expression and purification of recombinant scFv antibodies | 第65-66页 |
| 2.2.10 Purification and refolding of recombinant scFv antibodies | 第66页 |
| 2.2.11 Western blot analysis | 第66-67页 |
| 2.2.12 ELISA determination of expressed proteins | 第67页 |
| 2.2.13 Immunofluorescence assay | 第67-68页 |
| 2.2.14 Statistical analysis | 第68-69页 |
| 2.3 Results | 第69-79页 |
| 2.3.1 Phage display biopanning | 第69-70页 |
| 2.3.2 Affinity determination with ELISA and sequence analysis | 第70-72页 |
| 2.3.3 Selection of positive clone enrichment | 第72-73页 |
| 2.3.4 Recombinant formation and expression of scFv antibodies | 第73-75页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE and western blot analysis | 第75-76页 |
| 2.3.6 Binding affinity determination of expressed proteins | 第76-78页 |
| 2.3.7 Structural prediction of scFv fragments | 第78-79页 |
| 2.4 Discussion | 第79-81页 |
| 2.5 Conclusions | 第81-82页 |
| PARTⅢ Development of antibody drug conjugates by using single chain variable fragmentsagainst PD-L1 and intracellular tracking | 第82-100页 |
| 3.1 Introduction | 第82-85页 |
| 3.2 Methodology | 第85-88页 |
| 3.2.1 Reagents and cell lines | 第85页 |
| 3.2.2 Generation of drug conjugate | 第85页 |
| 3.2.3 Spectrophotometry analysis | 第85-86页 |
| 3.2.4 SDS-PAGE | 第86页 |
| 3.2.5 In vitro activity determination | 第86页 |
| 3.2.6 Immunofluorescence | 第86-87页 |
| 3.2.7 Intracellular trafficking | 第87页 |
| 3.2.8 Statistical analysis | 第87-88页 |
| 3.3 Results | 第88-96页 |
| 3.3.1 Engineering scFv-PD-L1 drug conjugate | 第88页 |
| 3.3.2 Spectrophotometry analysis | 第88-90页 |
| 3.3.3 SDS-PAGE analysis | 第90页 |
| 3.3.4 Western blotting | 第90-91页 |
| 3.3.5 In vitro studies | 第91-92页 |
| 3.3.6 Surface binding specificity and trafficking analysis | 第92-96页 |
| 3.4 Discussion | 第96-99页 |
| 3.5 Conclusions | 第99-100页 |
| PARTⅣ Generation of full length antibody and bioactive confirmation against PD-L1cancer cells | 第100-118页 |
| 4.1 Introduction | 第100-102页 |
| 4.2 Methodology | 第102-107页 |
| 4.2.1 Reagents, cell lines and plasmids | 第102页 |
| 4.2.2 Construction of pMH3-VH/VL recombinant vector | 第102-103页 |
| 4.2.3 PCR ligation to develop SP-VH/VL fragment | 第103页 |
| 4.2.4 Double digestion and recombinant pMH3-kH/kL vector construction | 第103页 |
| 4.2.5 Transformation and sequence analysis | 第103-104页 |
| 4.2.6 Transfection of CHO cells | 第104-105页 |
| 4.2.7 Purification of full length antibody | 第105页 |
| 4.2.8 ELISA determination | 第105页 |
| 4.2.9 Immunofluorescence analysis | 第105-106页 |
| 4.2.10 Flow cytometry analysis | 第106页 |
| 4.2.11 Statistical analysis | 第106-107页 |
| 4.3 Results | 第107-115页 |
| 4.3.1 Construction of optimized recombinant plasmid | 第107-110页 |
| 4.3.2 CHO cells transfection optimization | 第110-112页 |
| 4.3.3 Full length antibody purification | 第112-113页 |
| 4.3.4 Bioactivity determination | 第113-115页 |
| 4.4 Discussion | 第115-117页 |
| 4.5 Conclusions | 第117-118页 |
| PARTⅤ Major Findings and Future Perspectives | 第118-120页 |
| 5.1 Introduction | 第118-119页 |
| 5.2 Future Perspectives | 第119-120页 |
| REFERENCES | 第120-143页 |
| LISTS OF PUBLICATIONS | 第143-144页 |
