| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 背景：里氏木霉的研究进展 | 第10-27页 |
| 1.1 木霉属的分类鉴定 | 第10-11页 |
| 1.2 纤维素与丝状真菌的纤维素酶 | 第11-14页 |
| 1.2.1 纤维素 | 第11-12页 |
| 1.2.2 丝状真菌的纤维素酶 | 第12页 |
| 1.2.3 纤维素酶协同作用研究 | 第12-13页 |
| 1.2.4 纤维素酶反应的协同作用蛋白质 | 第13-14页 |
| 1.2.5 纤维素酶的反应条件研究 | 第14页 |
| 1.3 里氏木霉的发酵研究与进展 | 第14-16页 |
| 1.3.1 里氏木霉培养基的选择 | 第14-15页 |
| 1.3.2 里氏木霉生长诱导培养环境以及发酵环境的选择 | 第15-16页 |
| 1.4 里氏木霉的里氏木霉所产生的外切型葡聚糖水解酶Ⅰ强启动子PcbhI | 第16-22页 |
| 1.4.1 PcbhI启动子的碳源诱导激活 | 第16-17页 |
| 1.4.2 里氏木霉及其他真菌的纤维素酶诱导表达机制 | 第17-19页 |
| 1.4.3 PcbhI的序列结构 | 第19-22页 |
| 1.5 里氏木霉的分子操作研究 | 第22-25页 |
| 1.5.1 里氏木霉原生质体化学物理直接导入转化 | 第22页 |
| 1.5.2 生物介导的根瘤农杆菌介导的转化 | 第22-25页 |
| 1.5.3 里氏木霉的选择性标记 | 第25页 |
| 1.6 报告基因红色荧光蛋白 | 第25页 |
| 1.7 本文主要研究内容 | 第25-27页 |
| 第2章 材料与方法 | 第27-45页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-35页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 培养基原料与配方 | 第27-30页 |
| 2.1.3 实验用到的主要试剂 | 第30-34页 |
| 2.1.4 本实验引物序列 | 第34页 |
| 2.1.5 实验中用到的其他人工序列 | 第34-35页 |
| 2.1.6 实验主要仪器 | 第35页 |
| 2.2 实验方法 | 第35-45页 |
| 2.2.1 大肠杆菌质粒的试剂盒抽提 | 第36页 |
| 2.2.2 聚合酶链反应PCR | 第36-38页 |
| 2.2.4 PCR之后产物的加A处理 | 第38页 |
| 2.2.5 T-A Clone | 第38页 |
| 2.2.6 DNA的酶切反应 | 第38-39页 |
| 2.2.7 去除质粒上非必要酶切位点 | 第39页 |
| 2.2.8 酶切DNA片段与质粒片段的连接 | 第39页 |
| 2.2.9 DNA电泳胶的制备与DNA电泳 | 第39-40页 |
| 2.2.10 DNA电泳后的胶回收 | 第40页 |
| 2.2.11 目的质粒对E.coil DH5 α或者BL21的转化 | 第40页 |
| 2.2.12 挑取转化子 | 第40页 |
| 2.2.13 里氏木霉的孢子与菌丝体的获取 | 第40-41页 |
| 2.2.14 里氏木霉基因组的抽提 | 第41页 |
| 2.2.15 A.tumefaciens GV3101根瘤农杆菌感受态细胞的制备 | 第41页 |
| 2.2.16 质粒电激转化根瘤农杆菌GV3101感受态细胞 | 第41-42页 |
| 2.2.17 根瘤农杆菌介导的结合转移(AMT) | 第42页 |
| 2.2.18 里氏木霉转化重组子的筛选 | 第42页 |
| 2.2.19 报告基因的检测 | 第42-43页 |
| 2.2.20 葡萄糖标准曲线的绘制 | 第43页 |
| 2.2.21 外切葡聚糖酶活性测定 | 第43页 |
| 2.2.22 内切葡聚糖酶活性测定 | 第43页 |
| 2.2.23 纤维素酶总酶的活力测定 | 第43页 |
| 2.2.24 外源蛋白的表达获取 | 第43-44页 |
| 2.2.25 外源蛋白的纯化 | 第44页 |
| 2.2.26 蛋白质电泳胶的制备与电泳 | 第44-45页 |
| 第3章 对启动子CBHI与信号肽序列等一系列突变改造 | 第45-58页 |
| 3.1 强启动子Pcbh Ⅰ的选择与改造 | 第45-56页 |
| 3.1.1 启动子的选择 | 第45页 |
| 3.1.2 启动子Pcbh1的突变改造 | 第45-56页 |
| 3.2 信号肽序列的改造 | 第56页 |
| 3.3 同源交换臂的相对延长 | 第56页 |
| 3.4 小结 | 第56-58页 |
| 第4章 里氏木霉通用质粒载体系统的构建以及外源基因的表达 | 第58-76页 |
| 4.1 随机插入型质粒的构建 | 第58-60页 |
| 4.2 报告基因DsRed的获取与在随机插入型质粒中的表达构建 | 第60-62页 |
| 4.2.1 报告基因红色荧光蛋白DsRed的获取 | 第61页 |
| 4.2.2 随机插入型质粒红色荧光蛋白表达体系的构建 | 第61-62页 |
| 4.3 启动子改造效果的检测 | 第62-63页 |
| 4.4 定点插入型质粒的构建 | 第63-64页 |
| 4.5 报告基因DsRed在定点插入型质粒中的表达构建 | 第64-65页 |
| 4.6 红色荧光蛋白表达的检测 | 第65-66页 |
| 4.7 Pg-DsRed单克隆的筛选 | 第66-68页 |
| 4.8 定点插入型质粒与随机插入型质粒对cbh1酶活影响的检测 | 第68-70页 |
| 4.8.1 PCR检测 | 第68-69页 |
| 4.8.2 酶活检测 | 第69-70页 |
| 4.9 同源交换臂相对延长对结合转移率的影响 | 第70页 |
| 4.10 报告基因的表达与纯化 | 第70-72页 |
| 4.11 外源蛋白普鲁兰酶的表达 | 第72-74页 |
| 4.12 小结 | 第74-76页 |
| 第5章 总结与展望 | 第76-77页 |
| 参考文献 | 第77-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
