| 摘要 | 第10-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 1 引言 | 第13-23页 |
| 1.1 抑制支链氨基酸生物合成途径除草剂靶标的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.2 利用生物大分子筛选与其作用的活性小分子研究进展 | 第15-19页 |
| 1.2.1 利用生物大分子筛选与其作用的活性小分子的方法 | 第15-16页 |
| 1.2.2 药物与生物大分子相互作用研究进展 | 第16-19页 |
| 1.3 除草剂与拟南芥乙酰羟酸合成酶ATAHAS 相互作用的分子机理研究进展 | 第19-21页 |
| 1.3.1 AtAHAS 的结构 | 第19-20页 |
| 1.3.2 磺酰脲与咪唑啉酮对AtAHAS 的作用 | 第20-21页 |
| 1.4 研究目的和实验内容 | 第21-23页 |
| 1.4.1 研究的目的和意义 | 第21-22页 |
| 1.4.2 课题来源和研究内容 | 第22-23页 |
| 2 实验材料和仪器 | 第23-27页 |
| 2.1 供试材料 | 第23页 |
| 2.2 基本试剂及生产厂家 | 第23-24页 |
| 2.2.1 拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基的基因克隆与序列分析材料 | 第23页 |
| 2.2.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达材料 | 第23页 |
| 2.2.3 毕赤酵母表达系统的构建材料 | 第23-24页 |
| 2.2.4 酶活测定与荧光分析材料 | 第24页 |
| 2.3 培养基及溶液 | 第24-25页 |
| 2.4 仪器与厂家 | 第25-27页 |
| 3 实验方法 | 第27-40页 |
| 3.1 拟南芥乙酰羟酸合成酶催化亚基的基因克隆与序列分析 | 第27-31页 |
| 3.1.1 总RNA 提取方法 | 第27页 |
| 3.1.2 总 RNA 质量检测 | 第27页 |
| 3.1.3 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的合成 | 第27-28页 |
| 3.1.4 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的扩增 | 第28页 |
| 3.1.5 PCR 产物的纯化 | 第28-29页 |
| 3.1.6 JM 109 感受态细胞制备 | 第29页 |
| 3.1.7 目的基因与克隆载体的连接及转化 | 第29-30页 |
| 3.1.8 阳性克隆的鉴定 | 第30页 |
| 3.1.9 目的基因的核苷酸序列测定 | 第30-31页 |
| 3.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达、纯化活性分析 | 第31-34页 |
| 3.2.1 乙酰羟酸合成酶催化亚基在大肠杆菌中的表达 | 第31-32页 |
| 3.2.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基蛋白的纯化 | 第32-33页 |
| 3.2.3 包涵体复性 | 第33页 |
| 3.2.4 乙酰羟酸合成酶活性分析 | 第33-34页 |
| 3.3 乙酰羟酸合成酶在毕赤酵母中的表达及粗酶液活性分析 | 第34-38页 |
| 3.3.1 乙酰羟酸合成酶在毕赤酵母中表达载体的构建 | 第34-36页 |
| 3.3.2 重组质粒的线性化 | 第36-37页 |
| 3.3.3 乙酰羟酸合成酶催化亚基DNA 电转化法转化毕赤酵母 | 第37-38页 |
| 3.3.4 AHAS 在毕赤酵母中的诱导表达 | 第38页 |
| 3.3.5 培养基中粗酶活性测定 | 第38页 |
| 3.4 乙酰羟酸合成酶农药先导化合物筛选方法的建立 | 第38-40页 |
| 3.4.1 通过酶活性测方法筛选农药先导化合物 | 第38-39页 |
| 3.4.2 荧光法筛选农药先导化合物 | 第39-40页 |
| 4 结果与分析 | 第40-64页 |
| 4.1 乙酰羟酸合成酶催化亚基 cDNA 的克隆与序列分析 | 第40-46页 |
| 4.1.1 总RNA 质量检测 | 第40页 |
| 4.1.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基cDNA 的扩增 | 第40-41页 |
| 4.1.3 阳性克隆PCR 的鉴定 | 第41-42页 |
| 4.1.4 基因测序与序列提交 | 第42-45页 |
| 4.1.5 同源性分析 | 第45页 |
| 4.1.6 乙酰羟酸合成酶软件预测分析 | 第45-46页 |
| 4.2 乙酰羟酸合成酶催化亚基的原核表达 | 第46-49页 |
| 4.2.1 表达载体构建所需的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的获取 | 第46页 |
| 4.2.2 重组质粒转化JM109 后的菌落PCR 鉴定及质粒酶切鉴定 | 第46-47页 |
| 4.2.3 乙酰羟酸合成酶催化亚基重组蛋白的SDS-PAGE 检测 | 第47-48页 |
| 4.2.4 重组蛋白可溶性、纯化及复性的SDS-PAGE 检测 | 第48-49页 |
| 4.3 乙酰羟酸合成酶的真核表达 | 第49-53页 |
| 4.3.1 表达载体构建所需的乙酰羟酸合成酶催化亚基基因的获取 | 第49页 |
| 4.3.2 载体与目的基因连接方向鉴定 | 第49-50页 |
| 4.3.3 重组载体的酶切鉴定 | 第50页 |
| 4.3.4 重组质粒转化毕赤酵母的鉴定 | 第50-52页 |
| 4.3.5 9K-AHAS 基因的诱导表达 | 第52-53页 |
| 4.4 乙酰羟酸合成酶活性测定 | 第53-54页 |
| 4.4.1 标准曲线的绘制 | 第53-54页 |
| 4.4.2 大肠杆菌表达产物复性后酶活测定结果 | 第54页 |
| 4.4.3 酵母表达培养基上清粗酶活性测定结果 | 第54页 |
| 4.5 乙酰羟酸合成酶与两种农药及农药单嘧磺隆中间体的相互作用 | 第54-59页 |
| 4.5.1 三维荧光光谱 | 第54-55页 |
| 4.5.2 氯嘧磺隆对乙酰羟酸合成酶的荧光猝灭 | 第55-57页 |
| 4.5.3 氯嘧磺隆与乙酰羟酸合成酶的表观结合常数KA 以及结合位点数n | 第57-58页 |
| 4.5.4 氯嘧磺隆与乙酰羟酸合成酶上结合位置的求取 | 第58-59页 |
| 4.6 乙酰羟酸合成酶与咪草烟的相互作用 | 第59-62页 |
| 4.6.1 咪草烟对乙酰羟酸合成酶的荧光猝灭 | 第59-60页 |
| 4.6.2 咪草烟与乙酰羟酸合成酶的表观结合常数KA以及结合位点数n | 第60-61页 |
| 4.6.3 咪草烟与乙酰羟酸合成酶上结合位置的求取 | 第61-62页 |
| 4.7 乙酰羟酸合成酶与药物单嘧磺隆中间体的作用 | 第62-64页 |
| 5 讨论 | 第64-67页 |
| 5.1 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的克隆 | 第64页 |
| 5.2 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的原核表达与纯化 | 第64页 |
| 5.3 乙酰羟酸合成酶基因催化亚基的真核表达 | 第64-65页 |
| 5.4 乙酰羟酸合成酶重组蛋白活性测定 | 第65-66页 |
| 5.5 乙酰羟酸合成酶农药先导化合物筛选方法的建立与验证 | 第66-67页 |
| 6 结论 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第74页 |
