| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-17页 |
| 1.1 酵母菌表达系统 | 第11-13页 |
| 1.1.1 以rRNA为介导的整合载体 | 第11页 |
| 1.1.2 酵母表达系统构建 | 第11-13页 |
| 1.2 酵母高效表达系统的研究进展 | 第13页 |
| 1.2.1 S. cerevisiae的稳定高效表达系统 | 第13页 |
| 1.2.2 P. pastoris的稳定高效表达系统 | 第13页 |
| 1.2.3 其它酵母的稳定高效表达系统 | 第13页 |
| 1.2.4 工业酵母菌的遗传修饰研究进展 | 第13页 |
| 1.3 酵母转化方法研究进展 | 第13页 |
| 1.4 产甘油假丝酵母简介 | 第13-14页 |
| 1.4.1 酵母细胞的渗透压调解 | 第14页 |
| 1.4.2 C. glycerinogenes分子生物学方面的研究现状 | 第14页 |
| 1.5 GAP启动子的研究 | 第14页 |
| 1.6 酵母基因组中外源基因的拷贝数 | 第14页 |
| 1.7 2A肽在生物医药和生物技术中的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.8 生物质能源的利用-木糖的代谢途径 | 第15-16页 |
| 1.8.1 酵母细胞中的木糖代谢 | 第15页 |
| 1.8.2 木糖醇的用途概述 | 第15-16页 |
| 1.9 本论文的立题依据及主要研究内容 | 第16-17页 |
| 1.9.1 立题依据和研究意义 | 第16页 |
| 1.9.2 主要研究内容 | 第16-17页 |
| 第二章 重组整合型表达载体启动子获得及功能分析 | 第17-31页 |
| 2.1 引言 | 第17页 |
| 2.2 材料与方法 | 第17-21页 |
| 2.2.1 菌株及其培养条件 | 第17页 |
| 2.2.2 试剂及工具酶 | 第17-18页 |
| 2.2.3 主要使用仪器 | 第18页 |
| 2.2.4 C. glycerinogenes基因组DNA的提取 | 第18页 |
| 2.2.5 简并引物设计及CgGAP基因保守序列的获得 | 第18-19页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备及转化 | 第19页 |
| 2.2.7 质粒DNA的提取及验证 | 第19页 |
| 2.2.8 酵母总RNA的提取方法 | 第19页 |
| 2.2.9 酵母总RNA的纯化及反转录 | 第19-20页 |
| 2.2.10 CgGAP基因及其启动子全序列的获得 | 第20页 |
| 2.2.11 CgGAP基因的序列测定与生物信息学分析 | 第20页 |
| 2.2.12 CgGAP启动子的功能分析 | 第20-21页 |
| 2.3 结果 | 第21-30页 |
| 2.3.1 CgGAP基因保守序列的获得 | 第21页 |
| 2.3.2 CgGAP基因受渗透压调控荧光定量PCR分析 | 第21-22页 |
| 2.3.3 渗透压调控型启动子序列的获得 | 第22页 |
| 2.3.4 CgGAP基因的生物信息学分析 | 第22-27页 |
| 2.3.5 CgGAP启动子结构对比分析 | 第27-28页 |
| 2.3.6 渗透压调控型CgGAP启动子异源表达功能分析 | 第28-30页 |
| 2.4 本章小结 | 第30-31页 |
| 第三章 渗透压调控型重组整合型表达载体构建及特性的研究 | 第31-45页 |
| 3.1 引言 | 第31页 |
| 3.2 材料与方法 | 第31-35页 |
| 3.2.1 实验中使用的菌株、质粒及培养方法 | 第31页 |
| 3.2.2 试剂及工具酶 | 第31页 |
| 3.2.3 主要实验仪器 | 第31-32页 |
| 3.2.4 重组整合表达载体整合位点的获得 | 第32页 |
| 3.2.5 Zeocin筛选标记的验证分析 | 第32页 |
| 3.2.6 渗透压调控型重组整合表达载体的构建 | 第32-33页 |
| 3.2.7 转化质粒的中量制备及质粒的酶切验证 | 第33-34页 |
| 3.2.8 C. glycerinogenes感受态细胞的制备及电转化 | 第34页 |
| 3.2.9 重组整合表达载体转化子的验证 | 第34页 |
| 3.2.10 重组整合C. glycerinogenes转化子稳定性分析 | 第34-35页 |
| 3.2.11 重组C. glycerinogenes绿色荧光蛋白表达强度的检测 | 第35页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第35-44页 |
| 3.3.1 重组整合表达载体整合位点 5.8S rRNA序列的获得 | 第35-36页 |
| 3.3.2 筛选标记zeocin的可行性分析 | 第36-37页 |
| 3.3.3 C. glycerinogenes重组整合表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 3.3.4 绿色荧光蛋白基因gfp作为重组整合表达载体报告基因的分析 | 第38-40页 |
| 3.3.5 重组整合表达载体整合C. glycerinogenes基因组 | 第40-41页 |
| 3.3.6 重组整合表达载体pURGAP-gfp、pURGPD-gfp荧光强度的检测 | 第41页 |
| 3.3.7 重组整合C. glycerinogenes的稳定性分析 | 第41-42页 |
| 3.3.8 重组整合表达载体对重组C. glycerinogenes生长的影响 | 第42页 |
| 3.3.9 质粒浓度重组整合表达载体整合效率的影响 | 第42-43页 |
| 3.3.10 整合载体插入外源基因片段的大小对重组整合效率的影响 | 第43页 |
| 3.3.11 重组整合表达载体同源臂长度的影响 | 第43-44页 |
| 3.4 本章小结 | 第44-45页 |
| 第四章 重组整合表达载体转化体系的研究及优化 | 第45-56页 |
| 4.1 引言 | 第45页 |
| 4.2 材料与方法 | 第45-47页 |
| 4.2.1 试剂及工具酶 | 第45页 |
| 4.2.2 主要实验仪器 | 第45页 |
| 4.2.3 主要溶液的配制 | 第45-46页 |
| 4.2.4 C. glycerinogenes原生质体的制备 | 第46页 |
| 4.2.5 C. glycerinogenes原生质体的再生 | 第46-47页 |
| 4.2.6 C. glycerinogenes原生质体转化方法的建立 | 第47页 |
| 4.3 结果和分析 | 第47-55页 |
| 4.3.1 C. glycerinogenes原生质体的制备 | 第47-52页 |
| 4.3.2 C. glycerinogenes原生质体的再生 | 第52-53页 |
| 4.3.3 原生质体转化方法的建立及优化 | 第53-54页 |
| 4.3.4 绿色荧光蛋白的鉴定 | 第54-55页 |
| 4.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第五章 重组整合表达体系渗透压调控性能评估 | 第56-72页 |
| 5.1 引言 | 第56页 |
| 5.2 材料与方法 | 第56-58页 |
| 5.2.1 菌株及载体 | 第56页 |
| 5.2.2 渗透压培养基 | 第56页 |
| 5.2.3 不同来源GAP基因启动子的获得 | 第56-57页 |
| 5.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第57页 |
| 5.2.5 C. glycerinogenes原生质体的制备及转化 | 第57页 |
| 5.2.6 重组菌绿色荧光蛋白gfp基因拷贝数的确定 | 第57-58页 |
| 5.2.7 重组C. glycerinogenes SDS-PAGE全细胞电泳分析 | 第58页 |
| 5.2.8 C. glycerinogenes阳性转化子发光特性和荧光强度的检测 | 第58页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第58-71页 |
| 5.3.1 不同酵母来源GAP启动子重组整合表达载体的构建 | 第58-59页 |
| 5.3.2 整合载体绿色荧光蛋白gfp基因拷贝数的确定 | 第59-60页 |
| 5.3.3 重组菌SDS-PAGE全细胞电泳分析 | 第60-61页 |
| 5.3.4 不同浓度的NaCl对重组整合载体启动子的诱导作用 | 第61-62页 |
| 5.3.5 底物葡萄糖对重组整合载体启动子的渗透压诱导 | 第62-64页 |
| 5.3.6 不同浓度的KCl作为渗透压诱导剂对整合表达载体启动子的调解作用 | 第64-66页 |
| 5.3.7 山梨醇对重组整合表达载体的渗透压诱导作用 | 第66-67页 |
| 5.3.8 发酵产物小分子相溶物质甘油对重组整合表达载体启动子的影响 | 第67-69页 |
| 5.3.9 重组整合表达载体在不同温度下的应激反应 | 第69-70页 |
| 5.3.10 pH值对重组整合表达载体表达的影响 | 第70-71页 |
| 5.4 本章小结 | 第71-72页 |
| 第六章 渗透压调控型整合表达体系木糖代谢工程菌中的应用 | 第72-92页 |
| 6.1 引言 | 第72页 |
| 6.2 材料与方法 | 第72-75页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第72页 |
| 6.2.2 工具酶与试剂 | 第72-73页 |
| 6.2.3 培养基及培养条件 | 第73页 |
| 6.2.4 代谢木糖重组整合载体的构建 | 第73页 |
| 6.2.5 PCR扩增反应体系及反应条件 | 第73页 |
| 6.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第73页 |
| 6.2.7 质粒DNA的提取 | 第73-74页 |
| 6.2.8 C. glycerinogenes感受态的制备及转化 | 第74页 |
| 6.2.9 C. glycerinogenes的基因组提取 | 第74页 |
| 6.2.10 重组C. glycerinogenes的验证 | 第74页 |
| 6.2.11 重组整合载体XYL1、XYL2基因拷贝数的确定 | 第74页 |
| 6.2.12 酶活的测定方法 | 第74-75页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第75-90页 |
| 6.3.1 C. glycerinogenes代谢木糖重组表达载体的构建 | 第75-76页 |
| 6.3.2 重组C. glycerinogenes的验证 | 第76-77页 |
| 6.3.3 重组菌中XYL1、XYL2基因拷贝数的确定 | 第77页 |
| 6.3.4 重组C. glycerinogenes全细胞蛋白SDS-PAGE电泳分析 | 第77-78页 |
| 6.3.5 NADH标准曲线的制作 | 第78页 |
| 6.3.6 蛋白浓度标准曲线的制作 | 第78页 |
| 6.3.7 C. glycerinogenes中表达木糖醇脱氢酶XYL2基因生产甘油 | 第78-84页 |
| 6.3.8 表达木糖醇脱氢酶XYL2基因重组菌酶活的测定 | 第84-85页 |
| 6.3.9 C. glycerinogenes中过量表达木糖还原酶XYL1基因发酵木糖 | 第85-90页 |
| 6.4 本章小结 | 第90-92页 |
| 主要结论与展望 | 第92-94页 |
| 主要结论 | 第92-93页 |
| 展望 | 第93-94页 |
| 论文主要创新点 | 第94-95页 |
| 致谢 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-105页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第105页 |
