| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 绪论 | 第12-33页 |
| 1.1 聚酮类化合物的研究概述 | 第12-16页 |
| 1.1.1 聚酮类化合物及其聚酮合酶 | 第12-13页 |
| 1.1.2 聚酮类化合物的生物合成机制 | 第13-15页 |
| 1.1.3 聚酮类化合物的组合生物合成 | 第15-16页 |
| 1.2 Fostriecin研究概述 | 第16-19页 |
| 1.2.1 Fostriecin的结构及构效关系 | 第16-18页 |
| 1.2.2 Fostriecin抗肿瘤作用机制 | 第18页 |
| 1.2.3 Fostriecin的化学合成 | 第18-19页 |
| 1.2.4 Fostriecin生物合成机制 | 第19页 |
| 1.3 异源表达研究 | 第19-24页 |
| 1.3.1 异源表达宿主的选择 | 第20-22页 |
| 1.3.2 天然产物的异源表达 | 第22-23页 |
| 1.3.3 聚酮化合物的异源表达 | 第23-24页 |
| 1.4 Red/ET同源重组技术 | 第24-31页 |
| 1.4.1 Red/ET同源重组系统 | 第25-26页 |
| 1.4.2 Red/ET同源重组工程的应用 | 第26-28页 |
| 1.4.3 Red/ET技术用于大片段的拼接 | 第28页 |
| 1.4.4 Red/ET技术用于筛选标记构建 | 第28-31页 |
| 1.5 本论文选题依据和主要研究内容 | 第31-33页 |
| 1.5.1 选题依据与意义 | 第31页 |
| 1.5.2 研究目的与研究内容 | 第31-33页 |
| 2 Fostriecin生物合成基因簇的序列分析 | 第33-37页 |
| 2.1 引言 | 第33页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第33-34页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第33页 |
| 2.2.2 Fostriecin生物合成基因簇序列的分析 | 第33-34页 |
| 2.2.3 Fostriecin生物合成基因簇NCBI序列号申请 | 第34页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第34-36页 |
| 2.3.1 Fostriecin生物合成基因簇分析 | 第34-35页 |
| 2.3.2 Fostriecin的生物合成途径分析 | 第35-36页 |
| 2.4 本章小结 | 第36-37页 |
| 3 筛选标记及表达载体的构建 | 第37-54页 |
| 3.1 引言 | 第37页 |
| 3.2 实验材料与方法 | 第37-45页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第37-38页 |
| 3.2.2 主要仪器与试剂 | 第38-40页 |
| 3.2.3 大肠杆菌的培养以及保藏 | 第40-41页 |
| 3.2.4 大肠杆菌中DNA的提取与纯化 | 第41-42页 |
| 3.2.5 目的片段的PCR扩增及纯化 | 第42页 |
| 3.2.6 限制性内切酶酶切反应及琼脂糖凝胶电泳 | 第42-43页 |
| 3.2.7 感受态细胞的制备及转化 | 第43-44页 |
| 3.2.8 目的片段的定向克隆 | 第44-45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-52页 |
| 3.3.1 正负筛选标记pRC的构建 | 第45-47页 |
| 3.3.2 表达载体pMT和pCT的构建 | 第47-50页 |
| 3.3.3 表达载体p184的构建 | 第50-51页 |
| 3.3.4 表达载体p184与pMT的共存 | 第51-52页 |
| 3.4. 本章小结 | 第52-54页 |
| 4 Fostriecin聚酮合酶(PKSs)大肠杆菌异源表达 | 第54-75页 |
| 4.1 引言 | 第54-55页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第55-59页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第55页 |
| 4.2.2 主要仪器与试剂 | 第55-56页 |
| 4.2.3 链霉菌中基因组DNA的提取方法 | 第56-57页 |
| 4.2.4 低熔点琼脂糖凝胶中大片段DNA的操作方法 | 第57页 |
| 4.2.5 质粒DNA的去磷酸化以及平末端片段的克隆 | 第57-58页 |
| 4.2.6 重组转化子中目的片段的鉴定 | 第58页 |
| 4.2.7 目的基因簇在大肠杆菌中的表达 | 第58页 |
| 4.2.8 目的化合物的检测 | 第58-59页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第59-73页 |
| 4.3.1 重组载体pM-fosAB的构建 | 第59-65页 |
| 4.3.2 p15A复制子表达载体p8-fosAB的构建 | 第65-68页 |
| 4.3.3 ColEl复制子表达载体pM-fosCDEF的构建 | 第68-70页 |
| 4.3.4 Fostriecin聚酮合酶大肠杆菌表达系统的构建 | 第70-71页 |
| 4.3.5 Fostriecin聚酮合酶在大肠杆菌中的异源表达 | 第71-73页 |
| 4.4 本章小结 | 第73-75页 |
| 5 Fostriecin聚酮合酶(PKSs)链霉菌异源表达 | 第75-95页 |
| 5.1 引言 | 第75-77页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第77-81页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第77页 |
| 5.2.2 主要仪器与试剂 | 第77-78页 |
| 5.2.3 链霉菌的培养以及保藏 | 第78-79页 |
| 5.2.4 链霉菌原生质体的制备及转化 | 第79页 |
| 5.2.5 链霉菌转化子的鉴定 | 第79-80页 |
| 5.2.6 目的基因簇在链霉菌中的表达 | 第80页 |
| 5.2.7 链霉菌中RNA的提取纯化 | 第80页 |
| 5.2.8 RT-PCR | 第80-81页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第81-93页 |
| 5.3.1 整合型表达载体p6-fosAB的构建 | 第81-85页 |
| 5.3.2 游离型表达载体p4-fosCDEF的构建 | 第85-89页 |
| 5.3.3 Fostriecin聚酮合酶链霉菌表达系统的构建 | 第89页 |
| 5.3.4 Fostriecin聚酮合酶在链霉菌中的异源表达 | 第89-93页 |
| 5.4 本章小结 | 第93-95页 |
| 6 后修饰基因fosH大肠杆菌异源表达 | 第95-104页 |
| 6.1 引言 | 第95页 |
| 6.2 实验材料与方法 | 第95-99页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第95页 |
| 6.2.2 主要仪器与试剂 | 第95-97页 |
| 6.2.3 IPTG诱导目标蛋白表达 | 第97页 |
| 6.2.4 目标蛋白的分离、纯化及浓缩 | 第97页 |
| 6.2.5 SDS-PAGE电泳 | 第97-98页 |
| 6.2.6 Dephosphofostriecin制备纯化及结构鉴定 | 第98-99页 |
| 6.2.7 fosH编码蛋白的活性测定 | 第99页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第99-103页 |
| 6.3.1 FosH在大肠杆菌中的异源表达 | 第99-100页 |
| 6.3.2 FosH转化底物的制备与鉴定 | 第100-101页 |
| 6.3.3 FosH活性鉴定及功能定位 | 第101-103页 |
| 6.4 本章小结 | 第103-104页 |
| 7 结论与展望 | 第104-106页 |
| 7.1 结论 | 第104-105页 |
| 7.2 展望 | 第105-106页 |
| 创新点摘要 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-115页 |
| 附录A 常用仪器一览表 | 第115-116页 |
| 附录B 常用试剂一览表 | 第116-118页 |
| 附录C 表达系统S.lividansTK24发酵物的HPLC谱图 | 第118-119页 |
| 附录D Fostriecin的~1H NMR及~(13)C NMR谱图 | 第119-120页 |
| 附录E Dephosphofostriecin的~1H NMR及~(13)C NMR谱图 | 第120-121页 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 | 第121-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
| 作者简介 | 第123-124页 |
