| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第11-24页 |
| 1.1 脂肪酶概述 | 第11-13页 |
| 1.1.1 脂肪酶简介 | 第11-12页 |
| 1.1.2 根霉脂肪酶研究现状 | 第12-13页 |
| 1.2 异源表达系统简介 | 第13页 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 | 第13-17页 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达载体 | 第13-14页 |
| 1.3.2 大肠杆菌表达宿主菌 | 第14页 |
| 1.3.3 外源蛋白在大肠杆菌中的可溶表达 | 第14-15页 |
| 1.3.4 大肠杆菌中蛋白分泌途径 | 第15-17页 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 | 第17-22页 |
| 1.4.1 毕赤酵母系统表达载体 | 第18页 |
| 1.4.2 毕赤酵母系统表达宿主菌 | 第18页 |
| 1.4.3 外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略 | 第18-22页 |
| 1.5 本课题立题依据及主要研究内容 | 第22-24页 |
| 1.5.1 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 1.5.2 本研究的主要研究内容 | 第23-24页 |
| 第二章 融合表达提高脂肪酶在大肠杆菌中的可溶性 | 第24-40页 |
| 2.1 前言 | 第24页 |
| 2.2 材料与方法 | 第24-29页 |
| 2.2.1 培养基与溶液 | 第24-25页 |
| 2.2.2 菌株和质粒 | 第25-26页 |
| 2.2.3 主要试剂和仪器 | 第26页 |
| 2.2.4 大肠杆菌基因组的提取 | 第26页 |
| 2.2.5 大肠杆菌表达重组质粒的构建 | 第26-28页 |
| 2.2.6 大肠杆菌基因工程菌的诱导表达 | 第28页 |
| 2.2.7 大肠杆菌不同细胞组分的制备 | 第28页 |
| 2.2.8 镍离子亲和层析 | 第28-29页 |
| 2.2.9 脂肪酶水解活力的测定 | 第29页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第29-38页 |
| 2.3.1 脂肪酶在大肠杆菌中的表达 | 第29-31页 |
| 2.3.2 大肠杆菌膜蛋白基因的克隆及重组质粒的构建 | 第31页 |
| 2.3.3 膜蛋白与脂肪酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第31-33页 |
| 2.3.4 膜蛋白与脂肪酶融合蛋白在大肠杆菌细胞中的定位 | 第33页 |
| 2.3.5 大肠杆菌可溶性标签基因的克隆及重组质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.6 可溶性标签与脂肪酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第34-35页 |
| 2.3.7 可溶性标签与脂肪酶融合蛋白在大肠杆菌中的定位 | 第35-36页 |
| 2.3.8 大肠杆菌胞质氧化还原环境对重组蛋白表达的影响 | 第36-38页 |
| 2.4 本章小结 | 第38-40页 |
| 第三章 大肠杆菌II型分泌途径信号肽引导脂肪酶的分泌表达 | 第40-52页 |
| 3.1 前言 | 第40页 |
| 3.2 材料与方法 | 第40-43页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第40页 |
| 3.2.2 培养基与溶液 | 第40页 |
| 3.2.3 主要试剂和仪器 | 第40页 |
| 3.2.4 II型分泌途径信号肽筛选系列表达载体的构建 | 第40-42页 |
| 3.2.5 大肠杆菌基因工程菌的诱导表达 | 第42页 |
| 3.2.6 大肠杆菌不同细胞组分的制备 | 第42页 |
| 3.2.7 脂肪酶水解活力的测定 | 第42页 |
| 3.2.8 细胞存活率检测 | 第42-43页 |
| 3.2.9 透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）观察大肠杆菌 | 第43页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第43-50页 |
| 3.3.1 II型分泌途径信号肽系列载体的构建 | 第43页 |
| 3.3.2 II型分泌途径信号肽对脂肪酶在大肠杆菌中表达的影响 | 第43-47页 |
| 3.3.3 融合蛋白YcdO-MBP-proRCL“分泌”原因的初步分析 | 第47-50页 |
| 3.4 本章小结 | 第50-52页 |
| 第四章 基因剂量调控脂肪酶在毕赤酵母中的表达 | 第52-60页 |
| 4.1 前言 | 第52-53页 |
| 4.2 材料与方法 | 第53-55页 |
| 4.2.1 菌种和质粒 | 第53页 |
| 4.2.2 培养基 | 第53页 |
| 4.2.3 毕赤酵母电转化感受态的制备 | 第53页 |
| 4.2.4 电转化毕赤酵母 | 第53页 |
| 4.2.5 毕赤酵母基因组的提取 | 第53页 |
| 4.2.6 荧光定量PCR鉴定酵母基因组中外源基因拷贝数方法的建立 | 第53-55页 |
| 4.2.7 含有不同基因拷贝数毕赤酵母重组菌的发酵 | 第55页 |
| 4.2.8 胞外脂肪酶活力测定 | 第55页 |
| 4.2.9 毕赤酵母总RNA的提取及逆转录 | 第55页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第55-59页 |
| 4.3.1 荧光定量PCR鉴定毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数方法的建立 | 第55-57页 |
| 4.3.2 不同脂肪酶基因剂量的muts表型毕赤酵母基因工程菌的获得 | 第57页 |
| 4.3.3 基因剂量对muts表型毕赤酵母基因工程菌表达脂肪酶的影响 | 第57-59页 |
| 4.4 本章小结 | 第59-60页 |
| 第五章 伴侣蛋白PDI促进脂肪酶在毕赤酵母中的分泌表达 | 第60-67页 |
| 5.1 前言 | 第60页 |
| 5.2 材料与方法 | 第60-61页 |
| 5.2.1 菌种和质粒 | 第60页 |
| 5.2.2 培养基 | 第60页 |
| 5.2.3 重组质粒pPICZ-PDI的构建 | 第60-61页 |
| 5.2.4 毕赤酵母电转化感受态的制备 | 第61页 |
| 5.2.5 电转化毕赤酵母 | 第61页 |
| 5.2.6 含不同拷贝伴侣蛋白基因和脂肪酶基因重组菌拷贝数的鉴定 | 第61页 |
| 5.2.7 重组菌的摇瓶发酵 | 第61页 |
| 5.2.8 脂肪酶活力测定 | 第61页 |
| 5.2.9 毕赤酵母总RNA的提取及逆转录 | 第61页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第61-66页 |
| 5.3.1 伴侣蛋白基因PDI的克隆及重组质粒pPICZ-PDI的构建 | 第61-62页 |
| 5.3.2 共表达PDI的不同脂肪酶基因剂量muts表型毕赤酵母基因工程菌的获得 | 第62-63页 |
| 5.3.3 伴侣蛋白PDI与脂肪酶基因剂量相互作用机制的研究 | 第63-66页 |
| 5.4 本章小结 | 第66-67页 |
| 第六章 协同共表达伴侣蛋白ERO1p和PDI提高脂肪酶表达速率 | 第67-82页 |
| 6.1 前言 | 第67页 |
| 6.2 材料与方法 | 第67-68页 |
| 6.2.1 菌种和质粒 | 第67页 |
| 6.2.2 培养基 | 第67-68页 |
| 6.2.3 重组质粒pPIC3.5-ERO1 的构建 | 第68页 |
| 6.2.4 毕赤酵母电转化感受态的制备 | 第68页 |
| 6.2.5 电转化毕赤酵母 | 第68页 |
| 6.2.6 含不同拷贝伴侣蛋白基因和脂肪酶基因毕赤酵母基因工程菌拷贝数的鉴定方法 | 第68页 |
| 6.2.7 毕赤酵母基因工程菌的摇瓶发酵方法 | 第68页 |
| 6.2.8 脂肪酶活力测定 | 第68页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第68-81页 |
| 6.3.1 不同拷贝脂肪酶基因mut+表型毕赤酵母基因工程菌的筛选及鉴定 | 第68页 |
| 6.3.2 基因剂量对mut+表型毕赤酵母基因工程菌表达脂肪酶的影响 | 第68-70页 |
| 6.3.3 基因剂量对脂肪酶转录水平的影响 | 第70-71页 |
| 6.3.4 基因剂量对毕赤酵母胞内相关伴侣蛋白基因转录水平的影响 | 第71-73页 |
| 6.3.5 伴侣蛋白基因ERO1 的克隆及重组质粒的构建 | 第73-76页 |
| 6.3.6 不同拷贝数脂肪酶及伴侣蛋白基因mut+表型毕赤酵母基因工程菌的构建 | 第76-77页 |
| 6.3.7 共表达伴侣蛋白 ERO1p 或 PDI 对 mut+表型基因工程菌表达脂肪酶的影响 | 第77-78页 |
| 6.3.8 伴侣蛋白 ERO1p 和 PDI 协同作用对脂肪酶表达的影响 | 第78-81页 |
| 6.4 本章小结 | 第81-82页 |
| 主要结论与展望 | 第82-85页 |
| 主要结论 | 第82-84页 |
| 展望 | 第84-85页 |
| 论文创新点 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-98页 |
| 附录：表 | 第98-100页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第100-101页 |
