| 缩略词表 | 第8-9页 |
| 摘要 | 第9-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 前言 | 第18-22页 |
| 第一章 贝氏柯克斯体穿梭载体构建及转化方法建立 | 第22-49页 |
| 引言 | 第22页 |
| 1 材料 | 第22-27页 |
| 1.1 菌株、质粒及细胞 | 第22页 |
| 1.2 主要试剂 | 第22-23页 |
| 1.3 主要仪器 | 第23页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第23-27页 |
| 2 方法 | 第27-42页 |
| 2.1 贝氏柯克斯体穿梭载体的构建 | 第27-38页 |
| 2.1.1 贝氏柯克斯体穿梭载体介绍 | 第27页 |
| 2.1.2 引物设计与合成 | 第27-28页 |
| 2.1.3 贝氏柯克斯体的复苏与培养 | 第28页 |
| 2.1.4 贝氏柯克斯体基因组DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.1.5 不同目的序列片段的扩增 | 第29-30页 |
| 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳分析 | 第30-31页 |
| 2.1.7 PCR产物的纯化 | 第31页 |
| 2.1.8 融合PCR扩增目的序列 | 第31-32页 |
| 2.1.9 PCR产物酶切 | 第32-33页 |
| 2.1.10 酶切产物切胶纯化 | 第33-34页 |
| 2.1.11 酶切纯化产物的连接 | 第34页 |
| 2.1.12 连接产物的转化 | 第34-35页 |
| 2.1.13 阳性克隆的筛选 | 第35-36页 |
| 2.1.14 阳性克隆的培养与保存 | 第36-37页 |
| 2.1.15 穿梭载体的制备 | 第37-38页 |
| 2.2 穿梭载体电转化贝氏柯克斯体 | 第38-42页 |
| 2.2.1 贝氏柯克斯体感受态制备 | 第38页 |
| 2.2.2 电转化贝氏柯克斯体 | 第38-39页 |
| 2.2.3 克隆分纯贝氏柯克斯体转化菌 | 第39-40页 |
| 2.2.4 贝氏柯克斯体单克隆转化菌的扩大培养 | 第40页 |
| 2.2.5 贝氏柯克斯体转化菌感染BGM细胞 | 第40-42页 |
| 3 结果 | 第42-48页 |
| 3.1 穿梭载体的构建 | 第42-44页 |
| 3.2 p207GK穿梭载体电转化贝氏柯克斯体 | 第44-45页 |
| 3.3 贝氏柯克斯体转化菌克隆分纯 | 第45-48页 |
| 4 讨论 | 第48-49页 |
| 第二章 贝氏柯克斯体內源质粒缺失突变体的构建及表型鉴定 | 第49-89页 |
| 引言 | 第49页 |
| 1 材料 | 第49-51页 |
| 1.1 菌株、质粒及细胞 | 第49-50页 |
| 1.2 主要试剂 | 第50页 |
| 1.3 主要仪器 | 第50页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-75页 |
| 2.1 贝氏柯克斯体质粒DNA全序列分析 | 第51页 |
| 2.2 引物设计与合成 | 第51-55页 |
| 2.3 克隆质粒的构建 | 第55-61页 |
| 2.3.1 克隆质粒介绍 | 第55-56页 |
| 2.3.2 PCR扩增构建pAGK质粒所需序列片段 | 第56-57页 |
| 2.3.3 两步融合PCR扩增“P311-eGFP-P1169-Kan~R-pUC ori”串联序列 | 第57-59页 |
| 2.3.4 酶切纯化、连接与转化 | 第59-60页 |
| 2.3.5 pAGK阳性克隆的筛选、培养与保存 | 第60页 |
| 2.3.6 克隆质粒pAGC和pAGR的构建 | 第60页 |
| 2.3.7 克隆质粒pARK、pARC和pARR的构建 | 第60页 |
| 2.3.8 克隆质粒pAm K、pAmC和pAmR的构建 | 第60-61页 |
| 2.4 穿梭载体pRGK的构建 | 第61-63页 |
| 2.4.1 穿梭载体pRGK的介绍 | 第61-62页 |
| 2.4.2 PCR扩增“P311-eGFP-P1169-Kan~R”片段和RSF1010 ori载体骨架 | 第62-63页 |
| 2.4.3 PCR产物的纯化、酶切、连接、转化及pRGK阳性克隆筛选 | 第63页 |
| 2.4.4 穿梭载体pRGK的制备 | 第63页 |
| 2.5 穿梭载体pQGK的构建 | 第63-66页 |
| 2.5.1 穿梭载体pQGK介绍 | 第63-64页 |
| 2.5.2 PCR扩增“P311-eGFP-P1169-Kan~R-pUC ori”片段和QpH1质粒同源序列片段 | 第64页 |
| 2.5.3 PCR产物的纯化、酶切、连接、转化及pQGK阳性克隆筛选 | 第64-65页 |
| 2.5.4 穿梭载体pQGK的制备 | 第65-66页 |
| 2.6 穿梭载体pRGK和pQGK电转化贝氏柯克斯体 | 第66页 |
| 2.7 贝氏柯克斯体阳性转化菌的克隆分纯与培养 | 第66页 |
| 2.8 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体的鉴定和筛选 | 第66-67页 |
| 2.8.1 贝氏柯克斯体转化菌克隆株质粒DNA提取 | 第66页 |
| 2.8.2 贝氏柯克斯体转化菌克隆株内源质粒QpH1检测 | 第66-67页 |
| 2.9 贝氏柯克斯体内质粒拷贝数测定 | 第67-71页 |
| 2.9.1 Q-PCR标准质粒的介绍 | 第67-68页 |
| 2.9.2 Q-PCR标准质粒引物设计 | 第68-69页 |
| 2.9.3 Q-PCR标准质粒构建 | 第69页 |
| 2.9.4 Q-PCR质粒标准品制备 | 第69页 |
| 2.9.5 Q-PCR测定质粒相对拷贝数 | 第69-71页 |
| 2.10 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体扩大培养与分装保存 | 第71页 |
| 2.11 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体在ACCM-2 中生长曲线测定 | 第71-72页 |
| 2.12 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体在BGM细胞内生长曲线测定 | 第72页 |
| 2.13 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体在THP-1 细胞内生长曲线测定 | 第72-73页 |
| 2.14 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体感染SCID小鼠实验 | 第73-75页 |
| 2.14.1 Cb感染SCID小鼠 | 第73-74页 |
| 2.14.2 组织中Cb gDNA提取 | 第74页 |
| 2.14.3 Q-PCR定量分析组织中Cb含量 | 第74-75页 |
| 3 结果 | 第75-87页 |
| 3.1 贝氏柯克斯体內源质粒序列分析 | 第75-76页 |
| 3.2 克隆质粒的构建 | 第76-78页 |
| 3.3 穿梭载体的构建及转化贝氏柯克斯体 | 第78-80页 |
| 3.4 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体筛选与鉴定 | 第80-82页 |
| 3.5 贝氏柯克斯体转化菌内质粒拷贝数测定 | 第82-83页 |
| 3.6 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体的细胞内、细胞外增殖能力测定 | 第83-85页 |
| 3.7 贝氏柯克斯体质粒缺失突变体在SCID小鼠体内实验结果 | 第85-87页 |
| 4 讨论 | 第87-89页 |
| 第三章 贝氏柯克斯体内源质粒QpH1复制与分裂调控区的遗传学研究 | 第89-102页 |
| 引言 | 第89页 |
| 1 材料 | 第89-90页 |
| 1.1 菌株、质粒与细胞 | 第89页 |
| 1.2 主要试剂 | 第89页 |
| 1.3 主要仪器 | 第89页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第89-90页 |
| 2 方法 | 第90-98页 |
| 2.1 引物设计与合成 | 第90-91页 |
| 2.2 穿梭载体pQGK的改造 | 第91-97页 |
| 2.2.1 穿梭载体pQGK编码基因的删除突变体构建 | 第92-95页 |
| 2.2.2 穿梭载体pQGK的截断突变体构建 | 第95-97页 |
| 2.3 穿梭载体pQGK突变体的制备 | 第97页 |
| 2.4 穿梭载体pQGK突变体电转化贝氏柯克斯体 | 第97页 |
| 2.5 贝氏柯克斯体转化克隆株内QpH1质粒检测 | 第97-98页 |
| 3 结果 | 第98-101页 |
| 3.1 pQGK突变体的构建 | 第98-99页 |
| 3.2 pQGK突变体电转化贝氏柯克斯体与PCR鉴定分析 | 第99-101页 |
| 4 讨论 | 第101-102页 |
| 第四章 利福平在贝氏柯克斯体遗传转化实验中的探索应用 | 第102-111页 |
| 引言 | 第102页 |
| 1 材料 | 第102-103页 |
| 1.1 菌株、质粒与细胞 | 第102页 |
| 1.2 主要试剂 | 第102页 |
| 1.3 主要仪器 | 第102页 |
| 1.4 主要试剂配制 | 第102-103页 |
| 2 方法 | 第103-106页 |
| 2.1 穿梭载体pQGR构建 | 第103-104页 |
| 2.1.1 穿梭载体pQGR介绍 | 第103页 |
| 2.1.2 穿梭载体pQGR构建 | 第103-104页 |
| 2.1.3 穿梭载体pQGR的制备 | 第104页 |
| 2.2 穿梭载体pQGR电转化贝氏柯克斯体 | 第104页 |
| 2.3 穿梭载体pQGR转化克隆株细胞内、胞外增殖能力测定 | 第104-106页 |
| 2.3.1 细胞外增殖能力测定 | 第104页 |
| 2.3.2 细胞内增殖能力测定 | 第104-106页 |
| 3 结果 | 第106-110页 |
| 3.1 穿梭载体pQGR转化贝氏柯克斯体及胞外增殖能力测定 | 第106页 |
| 3.2 克隆株 Cb Grita Ⅱ/p QGR 胞内增殖能力测定 | 第106-110页 |
| 4 讨论 | 第110-111页 |
| 结论 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-115页 |
| 个人简历 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116页 |
