| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-13页 |
| 1.1 角蛋白概述 | 第9-10页 |
| 1.1.1 角蛋白结构组成 | 第9页 |
| 1.1.2 角蛋白资源的利用 | 第9页 |
| 1.1.3 角蛋白的加工方法 | 第9-10页 |
| 1.2 角蛋白酶 | 第10-11页 |
| 1.2.1 角蛋白酶的来源 | 第10页 |
| 1.2.2 角蛋白酶的性质 | 第10-11页 |
| 1.2.3 角蛋白酶的发酵 | 第11页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第11-12页 |
| 1.3.1 毕赤酵母简介 | 第11-12页 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统的优点 | 第12页 |
| 1.4 论文主要研究内容 | 第12-13页 |
| 第二章 材料方法 | 第13-21页 |
| 2.1 材料 | 第13-14页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第13页 |
| 2.1.2 酶和主要试剂 | 第13页 |
| 2.1.3 仪器 | 第13-14页 |
| 2.1.4 培养基 | 第14页 |
| 2.2 引物设计与合成 | 第14页 |
| 2.3 重组载体p PIC9k-ker D的构建 | 第14-16页 |
| 2.3.1 角蛋白酶基因ker D的扩增 | 第14页 |
| 2.3.2 质粒p PIC9k和ker D的双酶切 | 第14-15页 |
| 2.3.3 质粒p PIC9k和ker D的连接 | 第15页 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第15页 |
| 2.3.5 大肠杆菌JM109的转化 | 第15页 |
| 2.3.6 p PIC9k-ker D阳性转化子的筛选 | 第15-16页 |
| 2.4 重组P. pastoris SMD1168-p PIC9k-ker D的构建和筛选 | 第16-17页 |
| 2.4.1 p PIC9k-ker D的线性化 | 第16页 |
| 2.4.2 SMD1168感受态细胞的制备 | 第16页 |
| 2.4.3 转化SMD1168感受态细胞 | 第16页 |
| 2.4.4 重组子筛选 | 第16-17页 |
| 2.4.5 摇瓶筛选 | 第17页 |
| 2.4.6 角蛋白酶活力的测定 | 第17页 |
| 2.5 重组角蛋白酶酶学性质的探究 | 第17-19页 |
| 2.5.1 重组角蛋白酶的分离纯化 | 第17页 |
| 2.5.2 蛋白质浓度的测定 | 第17-18页 |
| 2.5.3 重组角蛋白酶的SDS-PAGE | 第18页 |
| 2.5.4 p H对重组角蛋白酶的影响 | 第18页 |
| 2.5.5 温度对重组角蛋白酶的影响 | 第18页 |
| 2.5.6 金属离子和表面活性剂等对重组角蛋白酶活性的影响 | 第18页 |
| 2.5.7 重组角蛋白酶的底物特异性 | 第18-19页 |
| 2.5.8 重组角蛋白酶的动力学参数 | 第19页 |
| 2.5.9 重组角蛋白酶对羊毛的作用 | 第19页 |
| 2.6 高密度发酵产酶过程的优化 | 第19-21页 |
| 2.6.1 高密度发酵 | 第19页 |
| 2.6.2 菌体干重测定 | 第19页 |
| 2.6.3 甘油含量测定 | 第19页 |
| 2.6.4 醇氧化酶活力的测定 | 第19-20页 |
| 2.6.5 双碳源混合流加对角蛋白酶表达的影响 | 第20页 |
| 2.6.6 p H对角蛋白酶表达的影响 | 第20页 |
| 2.6.7 NH_4~+浓度对角蛋白酶表达的影响 | 第20-21页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第21-37页 |
| 3.1 重组载体p PIC9k-ker D的构建 | 第21-22页 |
| 3.1.1 角蛋白酶基因ker D的扩增 | 第21页 |
| 3.1.2 重组载体p PIC9k-ker D的双酶切验证 | 第21-22页 |
| 3.2 重组P. pastoris SMD1168-p PIC9k-ker D的构建 | 第22-23页 |
| 3.2.1 重组毕赤酵母的平板筛选 | 第22页 |
| 3.2.2 重组毕赤酵母的菌落PCR | 第22页 |
| 3.2.3 重组毕赤酵母的摇瓶筛选 | 第22-23页 |
| 3.3 重组角蛋白酶的酶学性质的研究 | 第23-29页 |
| 3.3.1 重组角蛋白酶的分离纯化 | 第23页 |
| 3.3.2 重组角蛋白酶的SDS-PAGE | 第23-24页 |
| 3.3.3 p H对重组角蛋白酶活性的影响 | 第24-25页 |
| 3.3.4 温度对重组角蛋白酶活性的影响 | 第25-26页 |
| 3.3.5 金属离子和表面活性剂等对重组角蛋白酶活性的影响 | 第26-27页 |
| 3.3.6 底物特异性 | 第27-28页 |
| 3.3.7 动力学反应参数 | 第28页 |
| 3.3.8 重组角蛋白酶的应用性能验证 | 第28-29页 |
| 3.4 重组角蛋白酶发酵条件的优化 | 第29-37页 |
| 3.4.1 菌体生长阶段的甘油补料策略 | 第29-30页 |
| 3.4.2 双碳源混合流加的发酵策略 | 第30-32页 |
| 3.4.3 两步p H法对角蛋白酶产量的影响 | 第32-34页 |
| 3.4.4 NH_4~+浓度对角蛋白酶表达的影响 | 第34-37页 |
| 主要结论与展望 | 第37-39页 |
| 主要结论 | 第37页 |
| 展望 | 第37-39页 |
| 致谢 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-45页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第45页 |
