| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 目录 | 第6-9页 |
| 1 前言 | 第9-20页 |
| ·肝脏的功能、疾病与检测 | 第9-11页 |
| ·肝脏的功能 | 第9页 |
| ·肝脏的分类和检测指标总胆汁酸 | 第9-10页 |
| ·目前检测TBA的方法 | 第10-11页 |
| ·3α-羟类固醇脱氢酶检测TBA的原理 | 第11页 |
| ·3α-羟类固醇脱氢酶的其他应用 | 第11页 |
| ·利用基因工程制备3α-HSD的意义和基因工程的一般路线 | 第11-12页 |
| ·基因工程制备3α-HSD的意义 | 第11-12页 |
| ·基因工程一般路线 | 第12页 |
| ·基因工程上游技术3α-HSD的原核表达 | 第12-13页 |
| ·基因工程下游纯化技术 | 第13-15页 |
| ·简介 | 第13页 |
| ·蛋白纯化的三个阶段 | 第13-14页 |
| ·根据蛋白质的特点的分离手段 | 第14-15页 |
| ·层析填料简介 | 第15-19页 |
| ·凝胶层析(gel filtration chromatography) | 第15-16页 |
| ·离子交换层析(ion exchange chromatography) | 第16-17页 |
| ·亲和层析(affinity chromatography) | 第17-19页 |
| ·本课题的立题依据及研究内容 | 第19-20页 |
| ·本课题的立题依据 | 第19页 |
| ·本课题的研究内容 | 第19-20页 |
| 2 材料和方法 | 第20-39页 |
| ·实验材料 | 第20-24页 |
| ·细菌株 | 第20页 |
| ·质粒 | 第20页 |
| ·主要材料与试剂 | 第20-22页 |
| ·仪器与器材 | 第22页 |
| ·主要溶液的配制 | 第22-24页 |
| ·实验方法 | 第24-30页 |
| ·基因合成和引物设计 | 第24页 |
| ·3α-HSD-6HIS基因的PCR扩增 | 第24-25页 |
| ·PCR产物电泳检测 | 第25页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第25-26页 |
| ·PCR产物连接T载体 | 第26页 |
| ·T-HSD-6HIS质粒的提取 | 第26-27页 |
| ·T-HSD-6his质粒的酶切鉴定 | 第27页 |
| ·酶切及产物回收 | 第27-28页 |
| ·连接反应 | 第28页 |
| ·重组载体的转化 | 第28-29页 |
| ·阳性重组克隆的筛选和鉴定 | 第29-30页 |
| ·HSD重组蛋白的表达及表达条件的优化 | 第30-33页 |
| ·转化 | 第30页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第30页 |
| ·重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-Blot)鉴定 | 第30-32页 |
| ·重组蛋白表达及纯化条件的优化 | 第32-33页 |
| ·HSD蛋白的放大表达、细胞破碎和表达形式的确认 | 第33-34页 |
| ·放大表达HSD | 第33-34页 |
| ·破碎菌体 | 第34页 |
| ·HSD表达形式的确认 | 第34页 |
| ·HSD的活性测定 | 第34页 |
| ·HSD的纯化 | 第34-37页 |
| ·HSD的粗纯--硫酸铵沉淀 | 第34-35页 |
| ·HSD的精纯化-凝胶层析 | 第35-36页 |
| ·方法二---离子变换-DEAE纯化HSD | 第36-37页 |
| ·两种纯化方法的比较 | 第37页 |
| ·两种方法所得到蛋白的纯度比较 | 第37页 |
| ·两种方法所得到活性的得率的比较 | 第37页 |
| ·HSD成品稳定性试验 | 第37-39页 |
| ·PH值对HSD活性的影响 | 第37-38页 |
| ·温度对HSD活性的影响 | 第38页 |
| ·HSD的长期稳定性验 | 第38页 |
| ·HSD的冻干保护剂选择 | 第38-39页 |
| 3 结果与讨论 | 第39-58页 |
| ·基因合成和引物设计 | 第39页 |
| ·3α-HSD-6HIS基因的PCR扩增 | 第39-40页 |
| ·T-HSD-6his克降的构建和鉴定 | 第40-41页 |
| ·pThioHis A-HSD/pThioHis A-HSD-6HIS重组体的构建、转化及鉴定 | 第41-44页 |
| ·pThioHis A表达载体的选择 | 第41页 |
| ·pThioHis A-HSD/pThioHis A-HSD-6HIS重组体的构建 | 第41页 |
| ·重组体的菌落PCR鉴定 | 第41-42页 |
| ·重组克降的双酶切鉴定 | 第42-43页 |
| ·转化表达宿主菌表达及鉴定 | 第43-44页 |
| ·HSD蛋白的表达条件优化 | 第44-48页 |
| ·挑取HSD高表达的菌落 | 第44-45页 |
| ·最佳诱导温度的优化 | 第45页 |
| ·最佳IPTG浓度的确定 | 第45-46页 |
| ·最佳诱导时间的优化 | 第46-47页 |
| ·目的蛋白表达形式的分析 | 第47-48页 |
| ·HSD的纯化及纯化工艺探索 | 第48-53页 |
| ·HSD的硫酸铵分级沉淀 | 第48-49页 |
| ·HSD的分子筛纯化 | 第49-50页 |
| ·HSD的离子交换纯化 | 第50-51页 |
| ·不同纯化方法纯化效果比较 | 第51-53页 |
| ·HSD的保存工艺探索 | 第53-56页 |
| ·PH值对HSD的稳定性影响 | 第53页 |
| ·温度对HSD的稳定性影响 | 第53-54页 |
| ·4℃下HSD的长期稳定性试验 | 第54-55页 |
| ·HSD的冻干保护剂选择 | 第55-56页 |
| ·讨论 | 第56-58页 |
| 4 结论 | 第58-59页 |
| 5 展望 | 第59-60页 |
| 6 参考文献 | 第60-65页 |
| 7 论文发表情况 | 第65-66页 |
| 8 致谢 | 第66页 |
