| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略语表 | 第10-11页 |
| 1. 前言 | 第11-19页 |
| ·猪链球菌病 | 第11页 |
| ·猪链球菌2型毒力因子 | 第11-13页 |
| ·主要毒力因子 | 第11-12页 |
| ·新的毒力相关因子 | 第12-13页 |
| ·谷氨酰胺代谢和TCA循环及乌头酸酶概述 | 第13-19页 |
| ·谷氨酰胺代谢 | 第13-15页 |
| ·TCA循环 | 第15-18页 |
| ·乌头酸酶 | 第18-19页 |
| 2. 研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 3. 材料与方法 | 第20-35页 |
| ·材料 | 第20-26页 |
| ·菌株、质粒和培养条件 | 第20-21页 |
| ·动物和细胞 | 第21-22页 |
| ·主要药品和试剂 | 第22页 |
| ·主要使用仪器 | 第22页 |
| ·培养基及抗生素的配制 | 第22-23页 |
| ·主要溶液配制 | 第23-24页 |
| ·引物 | 第24-26页 |
| ·方法 | 第26-35页 |
| ·猪链球菌2型的复苏及基因组DNA的提取 | 第26页 |
| ·PCR扩增 | 第26页 |
| ·重叠延伸PCR介导的定点突变 | 第26-27页 |
| ·DNA的纯化与回收 | 第27页 |
| ·DNA与载体的连接反应 | 第27页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第27-28页 |
| ·连接产物的转化 | 第28页 |
| ·质粒的小量制备(碱裂解法) | 第28页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第28页 |
| ·蛋白质的诱导表达 | 第28-29页 |
| ·蛋白质的鉴定(SDS-PAGE) | 第29页 |
| ·蛋白纯化 | 第29-30页 |
| ·蛋白质浓度的测定 | 第30页 |
| ·电泳迁移率实验(EMSA) | 第30-31页 |
| ·RNA的提取 | 第31页 |
| ·RNA的反转录(RT-PCR) | 第31-32页 |
| ·实时荧光定量PCR(Real-time PCR) | 第32页 |
| ·猪链球菌2型感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·猪链球菌2型的电转化 | 第32页 |
| ·突变株的筛选和鉴定 | 第32-33页 |
| ·遗传稳定性分析 | 第33页 |
| ·菌落形态和溶血活性的比较 | 第33页 |
| ·细菌透射电子显微镜观察 | 第33页 |
| ·细胞感染实验 | 第33-34页 |
| ·小鼠的半数致死量实验 | 第34-35页 |
| 4. 结果与分析 | 第35-50页 |
| ·谷氨酰胺合成酶及GlnA及其转录因子GlnR对TCA循环酶调控的研究 | 第35-42页 |
| ·谷氨酰胺合成酶glaA及其转录因子glnR的克隆 | 第35页 |
| ·glnA基因的体外定点突变 | 第35-37页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第37-38页 |
| ·GlnR、GlnA及其突变蛋白的表达 | 第38-39页 |
| ·GlnA及其突变蛋白的酶活分析 | 第39-40页 |
| ·电泳迁移率实验 | 第40页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第40-42页 |
| ·猪链球菌2型乌头酸酶AcnA生物学特性研究 | 第42-50页 |
| ·乌头酸酶基因上下游同源臂和红霉素抗性基因的扩增 | 第42-43页 |
| ·温敏型自杀性重组质粒pSET4s-AcnA的构建 | 第43-44页 |
| ·猪链球菌2型AcnA基因缺失突变株△AcnA的筛选 | 第44-46页 |
| ·遗传稳定性鉴定 | 第46页 |
| ·生长曲线分析 | 第46页 |
| ·形态结构比较 | 第46-47页 |
| ·溶血活性比较 | 第47-48页 |
| ·细胞感染实验 | 第48页 |
| ·小鼠半数致死量 | 第48-50页 |
| 5. 讨论 | 第50-54页 |
| ·谷氨酰胺合成酶及其转录因子调控机制探讨 | 第50页 |
| ·关于TCA循环酶的选择 | 第50-51页 |
| ·关于乌头酸酶的选择 | 第51页 |
| ·重叠延伸PCR技术选择 | 第51-52页 |
| ·谷氨酰胺合成酶及其转录因子对TCA循环酶的调控 | 第52页 |
| ·突变株△AcnA的构建与筛选 | 第52页 |
| ·突变株△AcnA的生物学性状 | 第52-54页 |
| 6. 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
