| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 目录 | 第10-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-42页 |
| 1.极端环境微生物 | 第13-14页 |
| 2.蛋白酶 | 第14-20页 |
| ·蛋白酶概述和分类 | 第14-15页 |
| ·蛋白酶的应用 | 第15页 |
| ·丝氨酸蛋白酶 | 第15-20页 |
| 3.酶的温度适应机理 | 第20-25页 |
| ·嗜热酶 | 第20-21页 |
| ·嗜冷酶 | 第21-25页 |
| ·嗜热酶与嗜冷酶在应用上的局限性 | 第25页 |
| 4.蛋白质工程 | 第25-32页 |
| ·理性设计与定点突变 | 第26-27页 |
| ·非理性设计与定向进化 | 第27-30页 |
| ·半理性设计 | 第30-32页 |
| 5.异源表达系统 | 第32-34页 |
| ·真核表达系统 | 第32页 |
| ·原核表达系统 | 第32-34页 |
| 6.包含体 | 第34-39页 |
| ·包含体的组成 | 第34页 |
| ·包含体蛋白质复性的基本原则 | 第34-35页 |
| ·蛋白质复性方法 | 第35-38页 |
| ·包含体溶解性和活性 | 第38-39页 |
| 7.本研究的立题依据 | 第39-42页 |
| ·研究背景 | 第39页 |
| ·研究基础 | 第39-41页 |
| ·研究目标 | 第41页 |
| ·研究内容 | 第41页 |
| ·研究意义 | 第41-42页 |
| 第二章 WF146蛋白酶的温度适应分子机制 | 第42-88页 |
| 1.实验材料 | 第42-47页 |
| ·菌种和质粒 | 第42-44页 |
| ·药品及试剂 | 第44页 |
| ·溶液配制 | 第44-47页 |
| 2.实验方法 | 第47-58页 |
| ·芽胞杆菌WF146 DNA的提取 | 第47页 |
| ·重组质粒的构建 | 第47-51页 |
| ·定点突变(Site-directed mutagenesis) | 第51-53页 |
| ·突变体酶和野生型的表达 | 第53页 |
| ·酶的大底物分子底物水解活性测定 | 第53-54页 |
| ·野生型及突变体酶的定量分析 | 第54-55页 |
| ·野生型及突变体酶的纯化 | 第55-56页 |
| ·蛋白酶相对比活的分析 | 第56页 |
| ·蛋白酶稳定性的分析 | 第56-57页 |
| ·蛋白酶BSA共保温实验 | 第57页 |
| ·温度对蛋白酶水解活力影响的分析 | 第57页 |
| ·突变体和野生型蛋白酶低温活力的测定 | 第57-58页 |
| ·酶动力学参数测定 | 第58页 |
| 3.结果 | 第58-76页 |
| ·重组质粒的构建 | 第58-59页 |
| ·突变体稳定性与活性 | 第59-66页 |
| ·对大分子底物的低温活性的进一步优化 | 第66-76页 |
| 4.讨论 | 第76-87页 |
| ·酶稳定性和活性的关系 | 第76-77页 |
| ·对大分子底物的水解能力 | 第77-79页 |
| ·酶的温度适应分子机制 | 第79-87页 |
| 5.小结 | 第87-88页 |
| 第三章 WFT2蛋白酶基因克隆、表达及性质的初步研究 | 第88-121页 |
| 1.实验材料 | 第88-90页 |
| ·菌株和质粒 | 第88-89页 |
| ·药品及试剂 | 第89页 |
| ·溶液的配制 | 第89-90页 |
| 2.实验方法 | 第90-97页 |
| ·专一简并杂合引物(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers,CODEHOP)PCR | 第90-91页 |
| ·热不对称交错PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR TAIL-PCR) | 第91-94页 |
| ·包含体的提取 | 第94-95页 |
| ·包含体的溶解和蛋白质复性 | 第95页 |
| ·蛋白酶活性分析 | 第95-96页 |
| ·WFT2蛋白酶抗体制备 | 第96页 |
| ·蛋白质N末端测序 | 第96页 |
| ·Western-Blot | 第96-97页 |
| 3.结果 | 第97-113页 |
| ·WFT2蛋白酶基因的克隆 | 第97-101页 |
| ·WFT2蛋白酶的氨基酸序列及同源性分析 | 第101-104页 |
| ·WFT2蛋白酶的异源表达及功能的初步探索 | 第104-113页 |
| 4.讨论 | 第113-119页 |
| ·WFT2蛋白酶的自降解与稳定性 | 第113-114页 |
| ·WFT2蛋白酶与WF146蛋白酶的比较 | 第114-119页 |
| 5.小结 | 第119-121页 |
| 总结与展望 | 第121-123页 |
| 参考文献 | 第123-128页 |
| 在读期间发表的论文 | 第128-129页 |
| 致谢 | 第129页 |
