| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 引言 | 第12-26页 |
| 1.蚯蚓纤溶酶的应用价值 | 第12-13页 |
| 2.蚯蚓纤溶酶重组表达的研究进展 | 第13-15页 |
| 3.前期工作和实验基础 | 第15-16页 |
| 4.本课题的目的 | 第16页 |
| 5.本课题所用到的原核及真核表达载体的介绍 | 第16-19页 |
| ·温度诱导型表达载体pBV221 | 第16-17页 |
| ·融合型表达载体pTYB11 | 第17页 |
| ·融合型分泌表达载体pMAL-p2X | 第17页 |
| ·毕赤酵母多拷贝分泌型表达载体pPIC9K | 第17-19页 |
| 6.有关包含体复性方法的综述 | 第19-26页 |
| ·包含体的变性溶解 | 第19-20页 |
| ·变性包含体蛋白质的复性 | 第20-25页 |
| ·液相复性方法 | 第21-23页 |
| ·稀释法 | 第21页 |
| ·透析法 | 第21-22页 |
| ·超滤法 | 第22页 |
| ·反向微团萃取法 | 第22页 |
| ·双水相萃取法 | 第22-23页 |
| ·固相复性方法 | 第23-25页 |
| ·凝胶层析法 | 第23-24页 |
| ·离子交换层析法 | 第24页 |
| ·疏水层析法 | 第24页 |
| ·亲和层析法 | 第24-25页 |
| ·高压复性方法 | 第25-26页 |
| 第一章 实验材料 | 第26-33页 |
| 1.一般药品材料 | 第26-27页 |
| 2.主要试剂和培养基 | 第27-29页 |
| 3.其它试剂 | 第29-30页 |
| 4.试剂盒 | 第30页 |
| 5.相关质粒 | 第30页 |
| 6.菌株 | 第30-31页 |
| ·大肠杆菌Escherichia coli | 第30-31页 |
| ·毕赤酵母Pichia pastoris | 第31页 |
| 7.引物 | 第31页 |
| 8.主要实验仪器 | 第31-33页 |
| 第二章 蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中非融合表达及包含体复性 | 第33-41页 |
| 1.实验方法 | 第33-36页 |
| ·非融合型EFE在大肠杆菌中表达 | 第33-34页 |
| ·菌种活化与重组子鉴定 | 第33页 |
| ·非融合型EFE的诱导表达条件的优化 | 第33页 |
| ·非融合型EFE蛋白的诱导表达及纯化 | 第33-34页 |
| ·非融合型EFE包含体产物的复性 | 第34-36页 |
| ·确定溶解EFE包含体的最适尿素浓度 | 第34页 |
| ·EFE活性检测 | 第34-35页 |
| ·纤维蛋白平板法 | 第34页 |
| ·酪蛋白平板法 | 第34-35页 |
| ·底物电泳法 | 第35页 |
| ·包含体复性 | 第35-36页 |
| ·直接稀释法 | 第35页 |
| ·流加法 | 第35页 |
| ·稀释与透析联合法 | 第35页 |
| ·空气氧化法 | 第35页 |
| ·酶消化法 | 第35-36页 |
| 2.实验结果与分析 | 第36-39页 |
| ·非融合型EFE在大肠杆菌中表达 | 第36-38页 |
| ·菌种活化与重组子鉴定 | 第36页 |
| ·非融合型EFE的诱导表达条件的优化 | 第36-37页 |
| ·非融合型EFE蛋白的诱导表达及纯化 | 第37-38页 |
| ·非融合型EFE包含体产物的复性 | 第38-39页 |
| 3.讨论 | 第39-41页 |
| ·非融合型EFE在大肠杆菌中表达 | 第39页 |
| ·非融合型EFE包含体产物的复性 | 第39-41页 |
| 第三章 蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中与几丁质结合蛋白融合表达 | 第41-47页 |
| 1.实验方法 | 第41-42页 |
| ·菌种活化与重组子鉴定 | 第41页 |
| ·菌种的连续活化对CBD-EFE融合蛋白表达的影响 | 第41页 |
| ·不同浓度IPTG诱导CBD-EFE融合蛋白的表达 | 第41-42页 |
| ·CBD-EFE融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第42页 |
| 2.实验结果与分析 | 第42-45页 |
| ·菌种活化与重组子鉴定 | 第42-43页 |
| ·菌种的连续活化对CBD-EFE融合蛋白表达的影响 | 第43页 |
| ·不同浓度IPTG诱导CBD-EFE融合蛋白的表达 | 第43-44页 |
| ·CBD-EFE融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第44-45页 |
| 3.讨论 | 第45-47页 |
| 第四章 蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中与麦芽糖结合蛋白融合分泌表达 | 第47-55页 |
| 1.实验方法 | 第47-51页 |
| ·pMAL-p2X-EFE-7~#表达载体的构建 | 第47-48页 |
| ·EFE基因片段的制备 | 第47-48页 |
| ·pMAL-p2X载体的制备 | 第48页 |
| ·pMAL-p2X-EFE-7~#表达载体的连接 | 第48页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第48-49页 |
| ·pMAL-p2X-EFE-7~#表达载体的转化 | 第49页 |
| ·pMAL-p2X-EFE-7~#重组子的筛选鉴定 | 第49页 |
| ·诱导时间对MBP-EFE融合蛋白表达量的影响 | 第49页 |
| ·诱导MBP-EFE融合蛋白的分泌表达 | 第49-50页 |
| ·常规方法诱导分泌表达 | 第49-50页 |
| ·高浓度蔗糖诱导分泌法 | 第50页 |
| ·Triton、甘氨酸诱导分泌法 | 第50页 |
| ·渗透休克法提取周质蛋白 | 第50页 |
| ·MBP-EFE融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第50-51页 |
| 2.实验结果及分析 | 第51-53页 |
| ·pMAL-p2X-EFE-7~#重组子的鉴定 | 第51-52页 |
| ·诱导时间对MBP-EFE融合蛋白表达量的影响 | 第52页 |
| ·诱导MBP-EFE融合蛋白的分泌表达 | 第52-53页 |
| ·MBP-EFE融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第53页 |
| 3.讨论 | 第53-55页 |
| 第五章 蚯蚓纤溶酶在毕赤酵母中分泌表达 | 第55-60页 |
| 1.实验方法 | 第55-57页 |
| ·重组子表型验证 | 第55页 |
| ·菌落PCR验证重组子 | 第55页 |
| ·常规方法诱导表达 | 第55-56页 |
| ·改变培养基和温度诱导表达 | 第56页 |
| ·三氯醋酸法浓缩培养基上清 | 第56页 |
| ·Western blotting分析表达 | 第56-57页 |
| 2.实验结果与分析 | 第57-59页 |
| ·重组子的表型鉴定 | 第57页 |
| ·菌落PCR验证重组子 | 第57-58页 |
| ·常规方法诱导表达 | 第58-59页 |
| 3.讨论 | 第59-60页 |
| 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
