五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR检测研究
| 目录 | 第1-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 英文缩写 | 第11-12页 |
| 前言 | 第12-20页 |
| 1 腹泻的严重性 | 第12页 |
| 2 流行病学特征 | 第12-13页 |
| 3 DEC的病原学特性、致病因子及临床症状 | 第13-14页 |
| 4 当前检验技术 | 第14-19页 |
| ·常规分离培养方法 | 第14-15页 |
| ·免疫学检测方法 | 第15-16页 |
| ·清凝集试验 | 第15页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第15页 |
| ·免疫磁珠分离技术 | 第15-16页 |
| ·免疫金标技术 | 第16页 |
| ·分子生物学检测方法 | 第16-18页 |
| ·探针杂交 | 第16-17页 |
| ·依赖PCR的DNA指纹图谱技术 | 第17页 |
| ·多重及定量PCR检测技术 | 第17页 |
| ·基因芯片技术 | 第17-18页 |
| ·其他方法 | 第18-19页 |
| 5 本研究的目的、意义与主要研究内容 | 第19-20页 |
| 第一部分 单重PCR方法的建立 | 第20-33页 |
| 1 材料 | 第20-21页 |
| ·菌株 | 第20页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第20-21页 |
| 2 方法 | 第21-23页 |
| ·菌株的培养与保存 | 第21页 |
| ·引物设计 | 第21-22页 |
| ·DNA模板制备 | 第22页 |
| ·PCR扩增反应 | 第22页 |
| ·扩增产物的检测 | 第22页 |
| ·扩增产物的测序 | 第22-23页 |
| ·特异性的检测 | 第23页 |
| ·敏感性的测定 | 第23页 |
| ·单重PCR检测临床分离菌株 | 第23页 |
| 3 结果 | 第23-29页 |
| ·引物设计结果 | 第23-24页 |
| ·PCR扩增及特异性试验 | 第24-25页 |
| ·扩增产物的测序 | 第25-26页 |
| ·PCR扩增的敏感性 | 第26-28页 |
| ·单重PCR对临床分离菌株检测的结果 | 第28-29页 |
| 4 讨论 | 第29-32页 |
| ·特异性与靶基因及引物的选择 | 第29-30页 |
| ·模板制备 | 第30页 |
| ·敏感性 | 第30-31页 |
| ·关于PCR检测致病菌假阳性及假阴性结果 | 第31页 |
| ·临床分离菌株鉴定结果 | 第31-32页 |
| 5 小结 | 第32-33页 |
| 第二部分 多重PCR方法的建立及优化 | 第33-47页 |
| 1 材料 | 第33页 |
| ·菌株 | 第33页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第33页 |
| 2 方法 | 第33-36页 |
| ·多重PCR反应体系 | 第34页 |
| ·多重PCR反应条件 | 第34-35页 |
| ·PCR产物的检测 | 第35页 |
| ·引物特异性的测定 | 第35页 |
| ·多重PCR敏感性的测定 | 第35-36页 |
| ·多重PCR扩增临床分离菌株 | 第36页 |
| 3 结果 | 第36-42页 |
| ·多重PCR反应体系的优化 | 第36-39页 |
| ·Mg~(2+)浓度的优化 | 第36-37页 |
| ·缓冲液浓度的优化 | 第37页 |
| ·rTaq酶浓度的优化 | 第37-38页 |
| ·引物浓度的优化 | 第38-39页 |
| ·多重PCR反应条件的优化 | 第39-40页 |
| ·多重PCR特异性试验 | 第40页 |
| ·敏感性试验 | 第40-41页 |
| ·多重PCR扩增分离菌株的结果 | 第41-42页 |
| 4 讨论 | 第42-46页 |
| ·多重PCR扩增体系及条件的优化 | 第42-44页 |
| ·非特异条带及引物二聚体 | 第44-45页 |
| ·敏感性、特异性与重复性 | 第45-46页 |
| 5 小结 | 第46-47页 |
| 第三部分 PCR方法的应用 | 第47-62页 |
| 1 材料 | 第47页 |
| ·菌株 | 第47页 |
| ·模拟粪便标本制备 | 第47页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第47页 |
| 2 方法 | 第47-50页 |
| ·模拟标本中核酸提取 | 第47-50页 |
| ·低速差速离心集菌煮沸法 | 第48页 |
| ·中速差速离心集菌煮沸法 | 第48页 |
| ·集菌煮沸后纯化法 | 第48-49页 |
| ·直接煮沸法 | 第49页 |
| ·直接煮沸后纯化法 | 第49页 |
| ·集菌后提取基因组法 | 第49页 |
| ·粪便基因组提取试剂盒法 | 第49页 |
| ·多重模板模拟标本核酸的提取 | 第49-50页 |
| ·单一菌模拟标本增菌及核酸提取 | 第50页 |
| ·单重PCR扩增单一菌株模拟标本中的核酸 | 第50页 |
| ·多重PCR扩增多重模板模拟标本中提取的核酸 | 第50页 |
| 3 结果 | 第50-58页 |
| ·模拟标本中核酸提取方法的比较 | 第50-55页 |
| ·低速和中速差速离心集菌煮沸法的比较 | 第50-52页 |
| ·集菌煮沸法和直接煮沸法的比较 | 第52-53页 |
| ·集菌煮沸后纯化法和直接煮沸后纯化法的比较 | 第53-54页 |
| ·集菌煮沸后纯化法和集菌后提取基因组法的比较 | 第54页 |
| ·直接煮沸后纯化与试剂盒法比较 | 第54-55页 |
| ·多重PCR扩增多重模拟标本中提取的核酸 | 第55-56页 |
| ·标本增菌后的扩增结果 | 第56-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 5 小结 | 第60-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 综述 | 第67-76页 |
| 在读期间发表的论文 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
