| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 1 前言 | 第8-21页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第8-9页 |
| ·研究进展 | 第9-20页 |
| ·Bt杀虫晶体蛋白及其基因的研究进展 | 第9-14页 |
| ·苏云金芽孢杆菌的研究历史 | 第9页 |
| ·Bt杀虫蛋白基因的分类 | 第9-11页 |
| ·Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能 | 第11-12页 |
| ·对鞘翅目有杀虫活性蛋白的研究 | 第12-14页 |
| ·植物Bt抗虫基因工程研究进展 | 第14-20页 |
| ·Bt抗虫植物基因工程发展历程 | 第14-17页 |
| ·优化与提高转基因植物中Bt基因表达的措施 | 第17-19页 |
| ·转Bt抗鞘翅目害虫的植物基因工程简况 | 第19-20页 |
| ·本研究的具体内容 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-33页 |
| ·材料与仪器 | 第21-24页 |
| ·材料和菌株 | 第21页 |
| ·材料 | 第21页 |
| ·实验菌株 | 第21页 |
| ·质粒和载体 | 第21页 |
| ·重要仪器设备 | 第21-22页 |
| ·重要生化试剂 | 第22-23页 |
| ·抗生素和培养基 | 第23-24页 |
| ·抗生素及工作浓度 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23-24页 |
| ·实验方法 | 第24-33页 |
| ·质粒提取 | 第24页 |
| ·碱裂解法 | 第24页 |
| ·煮沸法 | 第24页 |
| ·载体构建 | 第24-25页 |
| ·酶切反应 | 第24页 |
| ·DNA片段的电泳回收 | 第24页 |
| ·连接 | 第24页 |
| ·转化 | 第24-25页 |
| ·筛选 | 第25页 |
| ·鉴定 | 第25页 |
| ·GFM cry3Bb杀虫基因的设计和人工合成 | 第25-27页 |
| ·Bt GFM cry3Bb杀虫基因的设计 | 第25-26页 |
| ·Bt GFM cry3Bb杀虫基因的人工合成 | 第26-27页 |
| ·GFM cry3Bb基因在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第27-28页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第27-28页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第28页 |
| ·包涵体蛋白的可溶性处理 | 第28页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第28页 |
| ·重组蛋白的Thrombin酶切 | 第28页 |
| ·抗体的制备及酶标记 | 第28-30页 |
| ·抗原的准备 | 第28-29页 |
| ·兔的免疫 | 第29页 |
| ·抗血清的制备 | 第29页 |
| ·抗体的纯化 | 第29页 |
| ·抗体的酶标记 | 第29-30页 |
| ·烟草的转化 | 第30页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第30页 |
| ·质粒导入根瘤农杆菌 | 第30页 |
| ·根瘤农杆菌的培养 | 第30页 |
| ·烟草无菌苗的准备 | 第30页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第30页 |
| ·转化烟草植株的获得 | 第30页 |
| ·转基因植株的分子检测 | 第30-31页 |
| ·烟草叶片DNA提取-CTAB法 | 第30页 |
| ·目的基因的PCR检测 | 第30-31页 |
| ·Southern blot检测 | 第31页 |
| ·转基因植株的ELISA检测 | 第31-33页 |
| ·样品提取方法 | 第31页 |
| ·标准曲线建立和总蛋白含量检测 | 第31-32页 |
| ·样品的ELISA检测 | 第32-33页 |
| 3 结果与分析 | 第33-43页 |
| ·BT GFM CRY3BB杀虫基因的合成 | 第33-35页 |
| ·设计的GFM cry3Bb基因完整序列 | 第33页 |
| ·人工合成cry3Bb基因及原始cry3Bb基因密码子选择偏向比较 | 第33页 |
| ·改造前后两基因碱基GC％含量的变化 | 第33-34页 |
| ·改造前后两基因的比较 | 第34页 |
| ·pBluscript-cry3Bb的构建和酶切鉴定结果 | 第34-35页 |
| ·合成的GFMcry3Bb基因测序结果 | 第35页 |
| ·双子叫植物表达载休PC-GENERAL-CRY3BB的构建和酶切鉴定 | 第35页 |
| ·细菌表达载体pGEX-4T-CRY3BB的构建、表达与纯化 | 第35-37页 |
| ·融合蛋白表达载体pGEX-4T-cry3Bb的构建 | 第35-36页 |
| ·融合蛋白的诱导表达与纯化 | 第36-37页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第36页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第36-37页 |
| ·融合蛋白的柱上酶切和纯化 | 第37页 |
| ·抗体的制备及酶标记 | 第37-40页 |
| ·高效价的Cry3Bb蛋白兔多抗的制备 | 第37页 |
| ·抗体的特异性 | 第37-39页 |
| ·酶标抗体及浓度的选择 | 第39-40页 |
| ·烟草的转化与检测 | 第40-43页 |
| ·烟草转化苗的获得 | 第40页 |
| ·转化植株的分子检测 | 第40-41页 |
| ·PCR检测转基因烟草T_0代 | 第40-41页 |
| ·转化植株Southern blot检测 | 第41页 |
| ·ELISA检测转基因烟草蛋白表达 | 第41-43页 |
| 4 讨论 | 第43-47页 |
| ·BT GFM CRY3BB杀虫基因的设计 | 第43-44页 |
| ·BT GFM CRY3BB杀虫基因的合成策略 | 第44-45页 |
| ·GFM CRY3BB基因在E.COLI中的表达，纯化和免疫 | 第45-46页 |
| ·GFM CRY3BB杀虫基因在转基因烟草中的表达 | 第46页 |
| ·需继续开展的研究 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| 附录 | 第51-70页 |
| 附录1 | 第51-57页 |
| 附录2 | 第57-59页 |
| 附录3 | 第59-60页 |
| 附录4 | 第60-62页 |
| 附录5 | 第62-63页 |
| 附录6 | 第63-64页 |
| 附录7 | 第64-68页 |
| 附录8 | 第68-69页 |
| 附录9 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
