| 1． 前言 | 第1-15页 |
| 1．1 植物抗真菌基因工程的理论依据 | 第6-7页 |
| 1．2 抗真菌基因工程策略及进展 | 第7-9页 |
| 1．2．1 病原真菌无毒基因与宿主抗病基因结合 | 第7页 |
| 1．2．2 从植物或微生物中分离抗真菌蛋白基因，并导入植物体成为转基因植物 | 第7-8页 |
| 1．2．2．1 几丁质酶和β-1，3葡聚糖苷酶 | 第7-8页 |
| 1．2．2．2 核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating-proteins） | 第8页 |
| 1．2．2．3 其它抗真菌蛋白 | 第8页 |
| 1．2．3 植物保卫素 | 第8-9页 |
| 1．2．4 转真菌酶抑制物基因 | 第9页 |
| 1．2．5 降解真菌产生的毒素 | 第9页 |
| 1．3 植物核糖体失活蛋白RIPs及基因工程研究进展 | 第9-14页 |
| 1．3．1 植物核糖体失活蛋白的主要性质、作用机理及分类 | 第9-11页 |
| 1．3．2 RIPs的功能 | 第11-13页 |
| 1．3．3 商陆核糖体失活蛋白（Pokeweed Anti-viral Protein，PAP）的研究进展 | 第13-14页 |
| 1．3．4 RIPs的基因工程进展 | 第14页 |
| 1．4 本论文的意义 | 第14-15页 |
| 2． 材料和方法 | 第15-24页 |
| 2．1 实验材料 | 第15页 |
| 2．1．1 菌种和质粒 | 第15页 |
| 2．1．2 植物材料 | 第15页 |
| 2．1．3 测试真菌 | 第15页 |
| 2．1．4 药品及试剂 | 第15页 |
| 2．1．5 引物 | 第15页 |
| 2．2 实验方法 | 第15-24页 |
| 2．2．1 大肠杆菌质粒提取 | 第15-16页 |
| 2．2．2 农杆菌质粒提取 | 第16-17页 |
| 2．2．3 质粒的酶切及载体与目的片段的连接 | 第17页 |
| 2．2．3．1 质粒限制性内切酶酶切 | 第17页 |
| 2．2．3．2 载体与目的片段的回收（此试剂盒购于北京鼎国公司） | 第17页 |
| 2．2．3．3 植物表达载体与目的片段的连接 | 第17页 |
| 2．2．4 大肠杆菌（E．coli）JM109感受态细胞的制备及转化 | 第17-18页 |
| 2．2．4．1 感受态细胞的制备（所有的操作均在无菌的条件下进行） | 第17-18页 |
| 2．2．4．2 质粒向大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第18页 |
| 2．2．5 农杆菌感受态制备及转化 | 第18-19页 |
| 2．2．6 引物设计与合成 | 第19页 |
| 2．2．7 目的DNA片段PCR扩增 | 第19页 |
| 2．2．8 含重组质粒菌落的鉴定 | 第19页 |
| 2．2．8．1 菌落直接PCR鉴定 | 第19页 |
| 2．2．8．2 重组质粒的酶切鉴定 | 第19页 |
| 2．2．9 烟草的基因转化 | 第19-20页 |
| 2．2．9．1 无菌苗的继代培养 | 第19页 |
| 2．2．9．2 PAP转化 | 第19-20页 |
| 2．2．10 Southern blot检测 | 第20-24页 |
| 2．2．10．1 总DNA提取 | 第20-21页 |
| 2．2．10．2 探针制备 | 第21页 |
| 2．2．10．3 植物DNA限制性内切酶酶切片段的琼脂糖凝胶分离 | 第21页 |
| 2．2．10．4 印迹 | 第21-22页 |
| 2．2．10．5 预杂交 | 第22-23页 |
| 2．2．10．6 杂交及放射自显影 | 第23页 |
| 2．2．10．7 洗膜 | 第23页 |
| 2．2．10．8 放射自显影 | 第23-24页 |
| 2．2．11 转基因烟草的抗病性实验 | 第24页 |
| 2．2．11．1 PDA培养基的配制 | 第24页 |
| 2．2．11．2 活体接种实验 | 第24页 |
| 3． 结果与分析 | 第24-33页 |
| 3．1 商陆核糖体失活蛋白基因PAP扩增 | 第24-25页 |
| 3．2 选用目的片段内部限制性内切酶酶切位点，进行酶切分析，验证目的片段的正确性 | 第25-26页 |
| 3．3 植物表达载体的构建及重组子鉴定 | 第26-27页 |
| 3．4 双元载体向农杆菌的导入及工程菌的鉴定 | 第27-28页 |
| 3．5 烟草转化牙的获得及继代筛选 | 第28-29页 |
| 3．6 烟草叶片转化率分析 | 第29-30页 |
| 3．7 烟草转化植株的移栽 | 第30-31页 |
| 3．8 转基因烟草植株的分子鉴定 | 第31-32页 |
| 3．8．1 PCR检测 | 第31页 |
| 3．8．2 Southern blot检测 | 第31-32页 |
| 3．9 感病实验分析 | 第32-33页 |
| 4． 讨论 | 第33-37页 |
| 4．1 引物设计策略 | 第33-34页 |
| 4．2 双元载体向根癌农杆菌的直接导入 | 第34页 |
| 4．3 工程菌的鉴定 | 第34-35页 |
| 4．4 PCR反应体系中模板的严格性对正确鉴定阳性重组体的影响 | 第35页 |
| 4．5 菌落直接PCR鉴定筛选重组子的技术的应用 | 第35页 |
| 4．6 PCR产物用于连接反应前的处理 | 第35-36页 |
| 4．7 工程菌菌株对转化率的影响 | 第36页 |
| 4．8 转化外源基因的稳定性分析 | 第36-37页 |
| 5． 结 论 | 第37-41页 |
