| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-16页 |
| 第一部分 VP7基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性 | 第16-34页 |
| 一、实验材料 | 第17-18页 |
| 二、实验方法 | 第18-21页 |
| 1.VP7基因的PCR扩增 | 第18页 |
| 2.重组原核表达载体的构建 | 第18-19页 |
| ·重组质粒pThioHisB-VP7_(TR)的构建 | 第18-19页 |
| ·重组质粒pGEX-KG-VP7_(TR)的构建 | 第19页 |
| 3.VP7_(TR)基因在大肠杆菌中的表达 | 第19页 |
| ·pThioHisB-VP7_(TR)在大肠杆菌中的表达 | 第19页 |
| ·pGEX-KG-VP7_(TR)在大肠杆菌中的表达 | 第19页 |
| ·基因表达条件的优化 | 第19页 |
| 4.VP7_(TR)重组蛋白的制备 | 第19-20页 |
| 5.VP7_(TR)重组蛋白的Western blot 检测 | 第20页 |
| 6.重组抗原VP7_(TR)的动物免疫实验研究 | 第20-21页 |
| ·重组抗原VP7_(TR)免疫小鼠实验 | 第20页 |
| ·重组抗原VP7_(TR)免疫家兔实验 | 第20-21页 |
| ·抗体检测 | 第21页 |
| 三、结果和分析 | 第21-30页 |
| 1.VP7_(TR)的PCR扩增 | 第21-23页 |
| 2.重组质粒pThioHisB-VP7_(TR)和pGEX-KG-VP7_(TR)的酶切鉴定 | 第23-24页 |
| 3.VP7_(TR)基因在大肠杆菌中的表达 | 第24-25页 |
| 4.VP7_(TR)重组蛋白的制备与纯化 | 第25-26页 |
| 5.VP7_(TR)重组蛋白的物Wstern Blot检测 | 第26-27页 |
| ·VP7_(TR)免疫动物抗体检测 | 第27-30页 |
| ·免疫荧光实验结果 | 第27-29页 |
| ·ELISA实验结果 | 第29-30页 |
| ·病毒中和实验 | 第30页 |
| 四、讨论 | 第30-34页 |
| 第二部分 基因修饰和联合免疫对VP7 DNA疫苗体液免疫应答的影响 | 第34-68页 |
| 一、实验材料 | 第35页 |
| 二、实验方法 | 第35-43页 |
| 1.野生型、分泌型和跨膜型VP7基因的构建 | 第35-41页 |
| 2.重组质粒pcDNA3-VP7wt、pcDNA3-VP7s和pcDNA3-VP7tm的构建 | 第41页 |
| 3.VP7wt、VP7s和VP7tm在Hela细胞中的稳定表达 | 第41-42页 |
| 4.DNA疫苗免疫动物实验 | 第42页 |
| 5.血清和肠道免疫反应的检测 | 第42-43页 |
| 三、实验结果 | 第43-63页 |
| 1.野生型、分泌型和跨膜型VP7基因的构建 | 第43-51页 |
| 2.重组质粒pcDNA3-VP7wt、pcDNA3-VP7s和pcDNA3-VP7tm的构建 | 第51-53页 |
| 3.VP7wt、VP7s和VP7tm在Hela细胞中的稳定表达 | 第53-58页 |
| 4.DNA疫苗免疫动物实验 | 第58-59页 |
| 5.DNA疫苗与VP7_(TR)重组抗原联合免疫动物实验 | 第59-63页 |
| 四、讨论 | 第63-68页 |
| 第三部分 表达VP7基因的重组腺病毒的构建及外源基因表达检测 | 第68-91页 |
| 一、实验材料 | 第69-71页 |
| 二、实验方法 | 第71-76页 |
| 1.基因克隆及重组质粒构建 | 第71-72页 |
| 2.重组腺病毒基因组的构建 | 第72-74页 |
| 3.在293细胞中产生重组腺病毒 | 第74-75页 |
| 4.重组腺病毒的鉴定及外源基因表达检测 | 第75-76页 |
| 三、实验结果 | 第76-86页 |
| 1.重组质粒pCMV2-EGFP、pCMV-2VP7wt和pCMV-2VP7tm的构建 | 第76-80页 |
| 2.重组质粒pShuttle-EGFP、pShuttle-VP7wt和pShuttle-VP7tm的构建 | 第80-81页 |
| 3.通过细菌内同源重组构建重组腺病毒基因组 | 第81-82页 |
| 4.重组腺病毒的产生 | 第82-83页 |
| 5.重组腺病毒基因组的PCR分析鉴定 | 第83页 |
| 6.外源基因表达检测 | 第83-86页 |
| 四、讨论 | 第86-91页 |
| 小结 | 第91-92页 |
| 展望 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-98页 |
| 综述 | 第98-119页 |
| 附录 | 第119-130页 |
| 作者简历 | 第130-131页 |
| 致谢 | 第131页 |
