| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-37页 |
| 1 菊粉酶的分类 | 第14-15页 |
| 2 菊粉酶对菊粉的水解作用及菊粉酶的应用 | 第15-16页 |
| ·果糖和果葡糖浆的生产 | 第15-16页 |
| ·利用菊粉酶生产酒精 | 第16页 |
| ·其它行业 | 第16页 |
| 3 微生物产菊粉酶的概况 | 第16-18页 |
| 4 菊粉酶的酶活测定 | 第18-19页 |
| 5 菊粉酶的生产 | 第19-21页 |
| ·液体发酵产菊粉酶 | 第19页 |
| ·固体发酵产菊粉酶 | 第19-21页 |
| 6 菊粉酶的分离纯化 | 第21-23页 |
| ·常用的分离蛋白的方法 | 第21-22页 |
| ·菊粉酶的分离纯化 | 第22-23页 |
| 7 菊粉酶的酶学性质 | 第23-25页 |
| 8 菊粉酶的基因克隆与表达 | 第25-32页 |
| ·基因组文库和cDNA 文库的构建和基因的筛选 | 第25-26页 |
| ·简并引物克隆和其它扩增方法相结合克隆基因 | 第26-30页 |
| ·简并引物的设计及克隆 | 第26页 |
| ·RACE 方法扩增基因全长 | 第26-30页 |
| ·目前关于菊粉酶基因克隆的研究 | 第30-32页 |
| 9 目前菊粉酶的研究现状及遇到的问题 | 第32-33页 |
| 10 海洋酵母的研究进展 | 第33-35页 |
| 11 本论文的研究目的与意义 | 第35-37页 |
| 第二章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）液体发酵产菊粉酶的研究 | 第37-52页 |
| 1 前言 | 第37-38页 |
| 2 材料和方法 | 第38-43页 |
| ·菌株 | 第38页 |
| ·培养基和试剂 | 第38-39页 |
| ·培养基 | 第38-39页 |
| ·试剂 | 第39页 |
| ·18S rRNA 部分基因和ITS 序列PCR 引物 | 第39页 |
| ·方法 | 第39-43页 |
| ·生理生化鉴定方法 | 第39-40页 |
| ·海洋酵母G7a 基因组的提取 | 第40-41页 |
| ·PCR 扩增体系及扩增条件 | 第41-42页 |
| ·液体发酵产菊粉酶种子液的制备 | 第42页 |
| ·液体发酵产菊粉酶的发酵方法 | 第42页 |
| ·菊粉酶酶活测定 | 第42页 |
| ·菊粉酶水解产物的薄层层析色谱（TLC） | 第42-43页 |
| 3 结果与讨论 | 第43-51页 |
| ·产菊粉酶酵母菌株G7a 的鉴定结果 | 第43-44页 |
| ·液体发酵中不同的碳源对G7a 细胞生长及产菊粉酶的影响 | 第44-45页 |
| ·液体发酵中不同氮源对G7a 细胞生长及产菊粉酶的影响 | 第45-46页 |
| ·液体发酵中不同的pH，温度对G7a 细胞生长及产菊粉酶的影响 | 第46-48页 |
| ·液体发酵过程中不同 Na~+和 Mg~（2+）浓度对细胞生长及产酶的影响 | 第48-49页 |
| ·菊粉酶水解菊粉后产物薄层层析结果 | 第49-50页 |
| ·菊粉酶的产酶时间曲线 | 第50-51页 |
| 4 本章小结 | 第51-52页 |
| 第三章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）菊粉酶的分离纯化和特性研究 | 第52-69页 |
| 1 前言 | 第52页 |
| 2 材料和方法 | 第52-58页 |
| ·试剂 | 第52-53页 |
| ·方法 | 第53-58页 |
| ·液体发酵产菊粉酶的方法 | 第53-54页 |
| ·菊粉酶发酵液浓缩 | 第54页 |
| ·超滤膜的预处理 | 第54页 |
| ·超滤 | 第54页 |
| ·超滤之后滤膜的处理 | 第54页 |
| ·聚乙二醇法将浓缩液进一步浓缩 | 第54页 |
| ·SephadexTM G-75 凝胶过滤 | 第54-55页 |
| ·DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换层析 | 第55-56页 |
| ·层析样品纯度测定 | 第56-57页 |
| ·菊粉酶最适反应温度和温度稳定性 | 第57页 |
| ·菊粉酶最适反应pH 和pH 稳定性 | 第57页 |
| ·金属离子对菊粉酶活性的影响 | 第57-58页 |
| ·不同化合物对菊粉酶活性的影响 | 第58页 |
| ·动力学常数Km 和最大反应速度Vmax 的测定 | 第58页 |
| ·菊粉酶水解产物的薄层层析色谱 | 第58页 |
| 3 结果与讨论 | 第58-68页 |
| ·菊粉酶发酵液浓缩及 SephradexTM G-75 凝胶层析部分纯化 | 第58-59页 |
| ·菊粉酶经DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换层析柱纯化 | 第59-60页 |
| ·纯化后菊粉酶不连续SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第60-61页 |
| ·纯化后菊粉酶最适温度和对温度的稳定性 | 第61-62页 |
| ·纯化后菊粉酶最适pH 和对pH 的稳定性 | 第62-63页 |
| ·不同化合物对纯化后菊粉酶活力的影响 | 第63-64页 |
| ·金属离子对菊粉酶酶活的影响 | 第64-65页 |
| ·底物浓度对菊粉酶活力的影响 | 第65-66页 |
| ·动力学常数Km 和最大反应速度Vmax | 第66-67页 |
| ·纯化后菊粉酶水解菊粉后产物薄层层析结果 | 第67-68页 |
| 4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）固体发酵生产菊粉酶的研究 | 第69-81页 |
| 1 前言 | 第69-70页 |
| 2 材料 | 第70-71页 |
| 3 方法 | 第71-73页 |
| ·固体发酵产菊粉酶的发酵方法 | 第71页 |
| ·接种量对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响 | 第71页 |
| ·初始pH 值对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响 | 第71页 |
| ·初始湿度对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响 | 第71页 |
| ·温度对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响 | 第71-72页 |
| ·不同底物配比对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响 | 第72页 |
| ·固体发酵中酶液的提取方法 | 第72页 |
| ·响应面分析法（RSM）实验设计 | 第72-73页 |
| 4 结果与讨论 | 第73-79页 |
| ·用响应面法对Cryptococcus aureus 产菊粉酶产酶条件进行优化 | 第73-77页 |
| ·Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶水解菊粉薄层层析结果 | 第77-78页 |
| ·Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶时间曲线 | 第78-79页 |
| 5 本章小结 | 第79-81页 |
| 第五章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）菊粉酶基因的克隆 | 第81-108页 |
| 1 前言 | 第81-82页 |
| 2 材料和方法 | 第82-89页 |
| ·菌株 | 第82页 |
| ·培养基和试剂 | 第82-84页 |
| ·培养基 | 第82-83页 |
| ·试剂 | 第83-84页 |
| ·方法 | 第84-89页 |
| ·海洋Cryptococcus aureus 基因组DNA 的提取 | 第84页 |
| ·简并引物的设计 | 第84页 |
| ·简并PCR 扩增 | 第84-85页 |
| ·RNA 提取 | 第85-86页 |
| ·RACE 方法扩增全长基因 | 第86页 |
| ·PCR 结果观察 | 第86页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第86-87页 |
| ·PCR 产物与T 载体连接 | 第87页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第87页 |
| ·大肠杆菌转化 | 第87-88页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第88页 |
| ·质粒提取 | 第88页 |
| ·阳性克隆质粒的酶切验证 | 第88页 |
| ·目的片断测序和比对 | 第88-89页 |
| ·菊粉酶基因ORF 框的获得 | 第89页 |
| ·菊粉酶生物信息学分析 | 第89页 |
| 3 结果和讨论 | 第89-107页 |
| ·海洋酵母基因组DNA 的提取 | 第89-90页 |
| ·简并PCR 引物的设计 | 第90-93页 |
| ·简并引物PCR 测序结果 | 第93-94页 |
| ·菊粉酶部分氨基酸序列在NCBI 中的比对结果 | 第94-95页 |
| ·RACE 方法获得菊粉酶全部基因 | 第95-96页 |
| ·RNA 提取 | 第95页 |
| ·5'-RACE，3'-RACE 进行基因扩增 | 第95-96页 |
| ·采用巢试引物对基因片段进行特异性扩增 | 第96页 |
| ·菊粉酶基因生物信息学分析 | 第96-107页 |
| ·ORF 框的获得 | 第96-98页 |
| ·从基因组水平扩增菊粉酶基因 | 第98-99页 |
| ·菊粉酶氨基酸序列保守性 | 第99-101页 |
| ·N-糖基化位点 | 第101页 |
| ·信号肽 | 第101-103页 |
| ·菊粉酶分子量 | 第103页 |
| ·菊粉酶氨基酸序列分析 | 第103-106页 |
| ·菊粉酶空间结构预测 | 第106-107页 |
| 4 本章小结 | 第107-108页 |
| 总结与创新点 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-124页 |
| 文章发表情况 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125页 |
