| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-9页 |
| 第一章 前言 | 第9-19页 |
| 1 Cho表达系统的研究进展 | 第9-13页 |
| 2 一次性生物反应器的应用 | 第13-14页 |
| 3 血小板衍生生长因子(PDGF)受体药物的研究进展 | 第14-15页 |
| 4 多聚阳离子PEI转染动物细胞机制的研究进展 | 第15-17页 |
| 5 本研究的意义和目的 | 第17页 |
| 6 本研究的创新点和特色 | 第17-18页 |
| 7 技术路线 | 第18-19页 |
| 第二章 实验材料与设备 | 第19-25页 |
| 1 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 2 常用试剂 | 第20页 |
| 3 DNA及蛋白酶 | 第20-21页 |
| 4 菌株、细胞株 | 第21页 |
| 5 培养基和抗生素 | 第21-22页 |
| 6 实验试剂 | 第22-24页 |
| ·工具酶 | 第22页 |
| ·分子量参照物 | 第22页 |
| ·转染试剂 | 第22页 |
| ·试剂配制 | 第22-24页 |
| 7 其它试剂及材料 | 第24-25页 |
| 第三章 实验方法与步骤 | 第25-38页 |
| 1 表达质粒的构建及测序分析 | 第25-31页 |
| ·sPDGFRa-Fc的片段的准备 | 第25-26页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·sPDGFRa-Fc片段PCR | 第25-26页 |
| ·表达载体的抽提 | 第26-27页 |
| ·sPDGFRa-Fc片段和表达载体的双酶切 | 第27-28页 |
| ·酶切产物的回收 | 第28页 |
| ·连接反应 | 第28页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5a的制备 | 第28-29页 |
| ·连接产物的转化 | 第29页 |
| ·重组子的鉴定 | 第29-30页 |
| ·PCR鉴定 | 第29-30页 |
| ·重组子的序列分析 | 第30页 |
| ·中抽表达质粒 | 第30-31页 |
| 2 转染DG44细胞 | 第31-33页 |
| ·DG44细胞的培养与冻存 | 第31页 |
| ·细胞活力的测定 | 第31页 |
| ·转染条件的摸索 | 第31-32页 |
| ·流式细胞仪测定转染效率 | 第32页 |
| ·表达质粒的转染 | 第32-33页 |
| 3 sPDGFRa-Fc的表达及鉴定 | 第33-36页 |
| ·ELISA检测目的蛋白的浓度 | 第33页 |
| ·Western blot鉴定[54] | 第33-36页 |
| ·细胞蛋白提取 | 第33页 |
| ·样品准备 | 第33-34页 |
| ·抽提蛋白定量(Bradford法) | 第34页 |
| ·SDS-PAGE胶配制 | 第34-35页 |
| ·上样电泳 | 第35页 |
| ·转膜 | 第35页 |
| ·抗体和目的蛋白的结合 | 第35-36页 |
| 4 马尔文粒径分析仪分析DNA-PEI复合物 | 第36-37页 |
| ·不同盐浓度对DNA-PEI复合物粒径大小的影响 | 第36页 |
| ·不同DNA-PEI质量比对复合物粒径大小的影响 | 第36页 |
| ·DNA-PEI复合物粒径大小与时间的关系 | 第36页 |
| ·经典的转染方法下,DNA-PEI复合物的粒径在基础培养基中的变化趋势 | 第36-37页 |
| 5 原子力显微镜观测DNA-PEI复合物微粒胞吞DG44细胞 | 第37-38页 |
| 第四章 结果 | 第38-51页 |
| 1 表达载体的构建 | 第38-41页 |
| 2 转染DG44细胞 | 第41-46页 |
| ·悬浮振荡培养与静置培养DG细胞的比较 | 第41-42页 |
| ·转染试剂的筛选 | 第42-43页 |
| ·pEGFP转染DG44细胞DNA:PEI最佳比例的摸索 | 第43-45页 |
| ·合适载体的筛选 | 第45-46页 |
| 3 目的蛋白的检测 | 第46-47页 |
| 4 马尔文粒径分析仪测定DNA-PEI复合物的粒径变化 | 第47-50页 |
| ·不同盐离子浓度对DNA-PEI复合物粒径的影响 | 第47-48页 |
| ·不同DNA-PEI比例对DNA-PEI复合物粒径大小 | 第48-49页 |
| ·DNA-PEI复合物的粒径在150mMOLNaCl随着时间的变化 | 第49页 |
| ·经典转染法DNA-PEI复合物在培养基中的变化趋势 | 第49-50页 |
| 5 原子力显微镜检测转染后细胞膜变化 | 第50-51页 |
| 第五章 讨论 | 第51-55页 |
| 1 瞬时转染方法 | 第51页 |
| 2. 50 mL一次性tubespin(?)细胞培养管培养CHO DG44细胞技术体系的建立 | 第51-52页 |
| 3 CHO表达系统表达糖基化蛋白 | 第52页 |
| 4 FC融合蛋白的优点 | 第52-53页 |
| 5 抗阻遏子的作用 | 第53-54页 |
| 6 影响转染效率因素的初步研究 | 第54-55页 |
| 结论与展望 | 第55-56页 |
| 1 、结论 | 第55页 |
| 2 、展望 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-62页 |
| 附录 | 第62-69页 |
| 附录1 在校期间发表文章 | 第62-68页 |
| 附录2 英文缩略词表 | 第68-69页 |
| 在学期间发表文章 | 第69-70页 |
| 经费资助 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
