| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 引言 | 第14-24页 |
| 1 TLR及其信号通路研究进展 | 第14-21页 |
| 1.1 TLR的发现 | 第14-15页 |
| 1.2 TLR分子结构特点 | 第15页 |
| 1.3 TLR种类及配体的识别关系 | 第15-18页 |
| 1.4 TLR信号转导途径 | 第18-21页 |
| 2 NF-?B家族研究进展 | 第21-22页 |
| 3 七鳃鳗简介 | 第22-23页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 第二章 东北七鳃鳗TLR基因克隆、表达分析及亚细胞定位 | 第24-60页 |
| 1 实验材料 | 第24-26页 |
| 1.1 实验用鱼及菌种 | 第24-25页 |
| 1.2 试剂 | 第25-26页 |
| 1.3 仪器设备 | 第26页 |
| 2 实验方法 | 第26-36页 |
| 2.1 东北七鳃鳗TLR基因克隆 | 第26-31页 |
| 2.1.1 东北七鳃鳗RNA提取 | 第26-27页 |
| 2.1.2 cDNA合成 | 第27-28页 |
| 2.1.3 引物设计 | 第28页 |
| 2.1.4 PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.1.5 PCR产物纯化回收 | 第29-30页 |
| 2.1.6 连接与转化 | 第30页 |
| 2.1.7 阳性克隆筛选及测序鉴定 | 第30-31页 |
| 2.1.8 TLR基因序列分析 | 第31页 |
| 2.2 东北七鳃鳗TLR基因组织表达分析 | 第31-34页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第31-32页 |
| 2.2.2 cDNA合成 | 第32-33页 |
| 2.2.3 TLR基因正常组织表达分析 | 第33页 |
| 2.2.4 TLR基因在铜绿假单胞菌刺激下的组织表达分析 | 第33-34页 |
| 2.3 东北七鳃鳗TLR基因亚细胞定位 | 第34-36页 |
| 2.3.1 pCMV-TLR真核表达载体构建 | 第34页 |
| 2.3.2 无内毒素质粒的提取 | 第34-35页 |
| 2.3.3 细胞免疫荧光实验 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-57页 |
| 3.1 TLR序列生物信息分析 | 第36-46页 |
| 3.1.1 TLR7a序列分析 | 第36-39页 |
| 3.1.2 TLR7b序列分析 | 第39-42页 |
| 3.1.3 TLR14d序列分析 | 第42-44页 |
| 3.1.4 TLR2d序列分析 | 第44-46页 |
| 3.2 TLR系统进化树分析 | 第46-48页 |
| 3.3 TLR基因正常组织表达分析 | 第48-50页 |
| 3.3.1 TLR7a组织表达分析 | 第48-49页 |
| 3.3.2 TLR7b组织表达分析 | 第49页 |
| 3.3.3 TLR14d组织表达分析 | 第49-50页 |
| 3.3.4 TLR2d组织表达分析 | 第50页 |
| 3.4 TLR基因在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第50-54页 |
| 3.4.1 TLR7a在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第50-51页 |
| 3.4.2 TLR7b在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第51-52页 |
| 3.4.3 TLR14d在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第52-53页 |
| 3.4.4 TLR2d在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第53-54页 |
| 3.5 pCMV-TLR真核表达载体构建 | 第54-55页 |
| 3.6 TLR基因亚细胞定位 | 第55-57页 |
| 3.6.1 TLR14d亚细胞定位 | 第55-56页 |
| 3.6.2 TLR2d亚细胞定位 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-60页 |
| 第三章 东北七鳃鳗TLR信号通路相关接头分子的克隆及表达分析 | 第60-75页 |
| 1 实验材料 | 第61页 |
| 1.1 实验用鱼及菌种 | 第61页 |
| 1.2 试剂 | 第61页 |
| 1.3 仪器设备 | 第61页 |
| 2 实验方法 | 第61-62页 |
| 2.1 东北七鳃鳗MyD88和TRAF6基因克隆 | 第61页 |
| 2.2 东北七鳃鳗MyD88和TRAF6基因表达分析 | 第61-62页 |
| 2.3 pCMV-MyD88和pCMV-TRAF6真核表达载体构建 | 第62页 |
| 2.4 无内毒素质粒的提取 | 第62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-73页 |
| 3.1 MyD88和TRAF6序列生物信息分析 | 第62-66页 |
| 3.1.1 MyD88序列分析 | 第62-63页 |
| 3.1.2 TRAF6序列分析 | 第63-66页 |
| 3.2 MyD88和TRAF6系统进化树分析 | 第66-69页 |
| 3.2.1 MyD88系统进化树分析 | 第66-67页 |
| 3.2.2 TRAF6系统进化树分析 | 第67-69页 |
| 3.3 MyD88和TRAF6正常组织表达分析 | 第69-70页 |
| 3.3.1 MyD88组织表达分析 | 第69页 |
| 3.3.2 TRAF6组织表达分析 | 第69-70页 |
| 3.4 MyD88和TRAF6在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第70-72页 |
| 3.4.1 MyD88在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第70-71页 |
| 3.4.2 TRAF6在铜绿假单胞菌刺激下的表达分析 | 第71-72页 |
| 3.5 pCMV-MyD88和pCMV-TRAF6真核表达载体构建 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-75页 |
| 第四章 东北七鳃鳗TLR信号通路下游转录因子NF-?B家族同源基因克隆、表达分析及启动子活性分析 | 第75-101页 |
| 1 实验材料 | 第75-76页 |
| 1.1 实验用鱼及菌种 | 第75-76页 |
| 1.2 试剂 | 第76页 |
| 1.3 仪器设备 | 第76页 |
| 2 实验方法 | 第76-80页 |
| 2.1 东北七鳃鳗NF-?B家族同源基因克隆 | 第76页 |
| 2.2 东北七鳃鳗NF-?B家族同源基因表达分析 | 第76-77页 |
| 2.3 东北七鳃鳗NF-?B家族同源基因的启动子活性分析 | 第77-80页 |
| 2.3.1 NF-?B家族同源基因启动子序列扩增 | 第77-78页 |
| 2.3.2 NF-?B家族同源基因启动子序列分析 | 第78-79页 |
| 2.3.3 NF-?B家族同源基因启动子荧光素酶质粒构建 | 第79页 |
| 2.3.4 无内毒素质粒的提取 | 第79页 |
| 2.3.5 重组质粒转染HEK293T细胞 | 第79-80页 |
| 2.3.6 双荧光素酶报告基因检测 | 第80页 |
| 3 结果与分析 | 第80-99页 |
| 3.1 NF-кB家族同源基因序列生物信息分析 | 第80-85页 |
| 3.1.1 Rel-a序列分析 | 第80-82页 |
| 3.1.2 Rel-b序列分析 | 第82-83页 |
| 3.1.3 Rel-c序列分析 | 第83-84页 |
| 3.1.4 Rel-d序列分析 | 第84-85页 |
| 3.2 NF-кB家族同源基因系统进化树分析 | 第85-87页 |
| 3.3 NF-кB家族同源基因正常组织表达分析 | 第87-90页 |
| 3.3.1 Rel-a组织表达分析 | 第87-88页 |
| 3.3.2 Rel-b组织表达分析 | 第88-89页 |
| 3.3.3 Rel-c组织表达分析 | 第89页 |
| 3.3.4 Rel-d组织表达分析 | 第89-90页 |
| 3.4 NF-кB家族同源基因的启动子生物信息分析 | 第90-98页 |
| 3.4.1 Rel-a启动子序列分析 | 第90-92页 |
| 3.4.2 Rel-b启动子序列分析 | 第92-94页 |
| 3.4.3 Rel-c启动子序列分析 | 第94-96页 |
| 3.4.4 Rel-d启动子序列分析 | 第96-98页 |
| 3.5 NF-кB家族同源基因的启动子荧光素酶质粒的鉴定 | 第98页 |
| 3.6 NF-кB家族同源基因的启动子活性检测 | 第98-99页 |
| 4 讨论 | 第99-101页 |
| 第五章 东北七鳃鳗TLR基因过表达对Rel-b启动子活性的影响 | 第101-106页 |
| 1 实验材料 | 第101-102页 |
| 1.1 试剂 | 第101页 |
| 1.2 仪器设备 | 第101-102页 |
| 2 实验方法 | 第102-103页 |
| 2.1 重组质粒转染HEK293T细胞 | 第102-103页 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因检测 | 第103页 |
| 3 结果与分析 | 第103-104页 |
| 3.1 TLR基因过表达对Rel-b启动子活性的影响 | 第103-104页 |
| 4 讨论 | 第104-106页 |
| 全文总结和展望 | 第106-108页 |
| 参考文献 | 第108-119页 |
| 附录一 本实验所用载体图谱 | 第119-121页 |
| 附录二 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第121-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
